人参皂甙Rg3抗肿瘤作用及机理的研究

发布日期:2020-07-07 15:18:42     浏览次数:36

人参作为中草药在亚州国家已有上千年的药用历史,尤其在中国、朝鲜和日本得到广泛应用,它的药理活性如补益、免疫调节和抗衰老等作用已被证实[1-3]。二十世纪以来,随着现代分离、分析技术的发展,人们鉴定了人参的多种成分,包括人参皂苷、多糖、萜类、黄酮、炔醇、有机酸、维生素、氨基酸、寡聚肽、糖类及无机盐等[4,5]。对各种成分的生物活性研究表明,人参的许多药理作用主要来源于人参皂甙。到目前为止,人参科属中已分离出60多种人参皂甙[4-14],这些皂甙成分具有多种特殊药理活性。

人参皂甙Rg3是存在于人参中的一种微量四环三萜皂甙,日本著名药学家北川勋(1982)首先鉴定了的分子结构[15],嗣后的研究又发现它具有选择性地抑制肿瘤细胞浸润和转移的药理作用[16]。最近十年来,中国在人参皂甙Rg3的抗肿瘤新药及作用机理的研究取得了重大成就,世界各国学者对人参皂甙Rg3的抗肿瘤作用及机理亦进行了广泛的研究,本文对人参皂甙Rg3(简称:Rg3)的抗肿瘤作用及作用机理的药理学研究成果作以综述。

 

1.人参皂甙Rg3抗肿瘤药理作用研究

1.1 Rg3体外对小鼠高转移肺癌细胞及内皮细胞的杀伤作用

中国中医研究院广安门医院李攻戍等(2000)[17]研究了人参皂甙Rg3对高转移肺癌细胞PG癌细胞系及内皮细胞的杀伤作用(MTT Assay)。用胰酶消化贴壁的PG细胞,接种4000/100μl/孔在96孔培养板内,24小时后试验组加入药物人参皂甙Rg3,阳性对照组加入MMC,空白对照组加入培养液;每孔100μl,置入37℃,5%CO2孵箱内培养4天。每孔加入MTT100μl,37℃培养4小时后,弃去液体,用100μl DMSO溶解,ELISA测定仪读A570nm值(OD值)。用0.25%胰蛋白酶:0.02%EDTA混合液(1:1)消化贴壁的内皮细胞,接种6000个/100μl/孔在96孔培养板内,24小时后实验组加入药物,空白对照组加入培养液,每孔100μl,置入37℃,5%CO2孵箱内培养4天。每孔加入MTT100μl,37℃培养4小时后,弃去液体,用100μl DMSO溶解,ELISA测定仪读A570nm值(OD值)。PG细胞和内皮细胞均按公式计算细胞存活率及杀伤率。实验结果显示,人参皂甙Rg3在体外对PG细胞有一定的抑瘤作用,大剂量500mg/ml对PG瘤细胞抑制率为52.5%,但对内皮细胞增殖的抑制作用较弱。

1.2 Rg3体内对小鼠动物移植性肿瘤及裸鼠人体移植性肿瘤的抑制作用

上海医药工业研究院严惠芳、陆宏祺与大连天富天然药物研究所富力、鲁岐(1995)[18]合作,研究了人参皂甙Rg3对不同动物移植肿瘤的抑瘤作用。结果表明,人参皂甙Rg3对三种实体瘤有明显的抑制作用。口服和静脉给药的剂量分别为3mg/kg、1.5mg/kg,B16黑色素瘤的平均抑瘤率分别约为60%和63%,对S180肉瘤的平均抑瘤率分别为55%和65%,对Lewis的平均抑瘤率44%和51%;对裸鼠手术原位接种人体胃癌MGC细胞肝转移的生命延长率为70.2%。

李茂德、陈大富、赵扬冰[19]研究了人参皂甙Rg3对裸鼠原位接种人乳腺浸润性导管癌的作用,将移植人乳腺浸润性导管癌的雌性裸鼠15只,随机分为Rg3组、环磷酰胺(CTX)组和0.5%羧甲基纤维素钠对照组(0.5%-CMC),分别连续灌胃给药Rg3、CTX和0.5%-CMC 混悬液56天,结果Rg3组瘤重(0.84±0.26g)低于对照组(1.20±0.24g),但与CTX组瘤重(0.75±0.23g)无明显差异。免疫组化显示,Rg3组微血管密度[(MVD)16.68±0.08,p<0.05]明显低于对照组(30.36±6.25),Rg3组血管内皮生长因子(VEGF)明显低于对照组(p<0.05),而CTX组的MVD(26.30±5.83,p>0.05)和VEGF与对照组无明显差异。

李攻戍等(2000)[17]研究了人参皂甙Rg3对PG肺癌细胞种植性裸鼠自发性肺转移模型的抑制作用。取BABL/c裸小鼠,4-5周龄,雄性,24只,随机分为空白对照组、荷瘤对照组、治疗组。体外培养PG细胞,消化收集细胞后,计数调整细胞浓度至1×106个/ml,每只裸鼠右腋皮下种植注射0.2 ml(含2.5×106个/ml细胞)。接种后24小时开始灌胃给药,每日0.2ml,荷瘤对照组予生理盐水0.2ml灌胃。连续观察6周后统一处死解剖,测定瘤重,计算局部肿瘤抑瘤率。Rg3高剂量组(12mg/kg)口服给药,对PG肺癌细胞种植性裸鼠肿瘤增殖的抑瘤率为43.3%,与对照组相比有显著差异(P<0.05)。

1.3 Rg3对小鼠动物移植性肿瘤及裸鼠人体移植性肿瘤转移的抑制作用研究

1.3.1 Rg3对动物和人体移植性肿瘤肺转移、肝转移的抑制作用

严惠芳、富力等(1995)[18]证实人参皂甙Rg3口服(0.12、0.6、3.0 mg/kg)和静脉(0.06、0.3、1.5 mg/kg)给药对小鼠不同动物移植性肿瘤及裸鼠人体移植性肿瘤的转移均有较明显的抑制作用;其中,口服和静脉给药的高剂量组对小鼠B16黑色素瘤实验肺转移平均抑制率分别为60%69%, 对小鼠Lewis肺癌自发肺转移平均抑制率分别为和69%、78%,对人肠癌LOVO脾脏接种肝转移生命平均延长率分别为52.0%、59.8%;口服给药高剂量组对小鼠H22肝癌肝转移延长生命平均延长率为46.4%。

1.3.2 人参皂甙Rg3对高转移的B16-BL6黑色素瘤和26-3.1结肠癌实验肺转移的抑制作用

Mochizuki等[20-22] 研究了人参皂甙Rg3对两个高转移细胞株B16-BL6黑色素细胞瘤和26-3.1结肠癌的肺转移的影响,结果发现接种了肿瘤细胞的小鼠连续静脉注射人参皂甙Rg3100mg,可明显降低黑色素细胞瘤的肺转移,静脉注射人参皂甙Rg310mg,对黑色素细胞瘤的肺转移也有抑制作用;同时发现,口服人参皂甙Rg3 100-1000mg黑色素细胞瘤的肺转移有抑制作用,并证实人参皂甙Rg3对26-3.1结肠癌的肺转移也有抑制作用,但对原发瘤的生长并无明显影响。

1.3.3 人参皂甙Rg3对高转移结肠癌腹膜转移的抑制作用

Iishi等[23-27] 用大鼠结肠癌模型研究了人参皂甙Rg3对结肠癌腹膜转移的影响,发现Rg3给药组的腹膜转移率仅为13%,而对照组则高达51%;同时发现Rg3对结肠癌腹膜转移的抑制作用具有剂量依赖性,静脉给药2.5mg/kg时腹膜转移率为39%,而剂量增加为5.0mg/kg时,转移率仅为13%。该试验还表明Rg3对该模型肿瘤的原发瘤发生部位、组织学类型、浸润深度、生长方式及侵袭性等无明显影响。

1.3.4 人参皂甙Rg3对膀胱癌肺转移和淋巴转移的抑制作用

杨威(2000)[28-31]应用爪垫接种鼠源性膀胱肿瘤细胞BBT739,建立了小鼠转移模型,连续腹腔注射40天Rg3 0.3-3.0mg/kg,与解剖显微镜下观察肺转移灶及相关淋巴结的转移灶大小和转移数目。结果表明,Rg3高剂量组(3.0mg/kg)对BBT739肺转移的抑制率为56.8%,并观察到腹股沟区的肿瘤组织侵出较轻,肾门淋巴结受累较少,腹股沟淋巴结未见转移灶,与对照组有显著差异(P<0.01)。

1.4 人参皂甙Rg3对与化疗药物合用的增效及减毒作用

日本学者Tong CN, Matsuda等(1992)[32]研究发现,人参皂甙Rg3能增加Ehlich腹水癌细胞对化疗药物丝裂霉素C(MMC)的吸收及该药的细胞毒活性。严惠芳、富力等(1995)[18] 研究证实,人参皂甙Rg3合并化疗药物环磷酰胺(CTX)、甲氨蝶呤(MTX)及丝裂霉素(MMC),与单独化疗组相比,S180肉瘤(皮下接种)的实体瘤和H22肝腹水癌均具有明显的协同增效趋势,尤其对H22肝腹水癌有明显的增效效果,且观察期间有动物存活,甚至超过单独化疗组,此结果对临床具有较重要的参考价值。人参皂甙Rg3合并化疗,能明显减轻化疗的毒副反应,对白细胞、红细胞及血小板数有明显的保护作用,使它们维持在正常值范围内或接近正常值。人参皂甙Rg3还对诱导的8天龄新生大鼠脱毛模型有较明显的治疗脱毛作用,高剂量组(3mg/kg)的脱毛拮抗率为71.43%

1.5 人参皂甙Rg3提高肌体免疫功能的作用

严惠芳、富力等(1995)[18,33] 及王庭富(1999)等[34] 的研究先后证实,人参皂甙Rg3可明显提高小鼠碳粒廓清速率、提高荷瘤小鼠的免疫器官(脾脏和胸腺)重量、血清血色素含量、B淋巴细胞转化能力、NK细胞活性,从而提高小鼠非特异性免疫功能和特异性免疫(包括细胞免疫和体液免疫)功能。这种促进免疫功能增强的作用表现一定的量效以来关系,以1.5-3.0 mg/kg为最佳剂量范围。

1.6 人参皂甙Rg3抗肿瘤作用的临床研究

中国中医研究院北京广安门医院等8家SDA临床药理研究基地,对人参皂甙Rg3的口服制剂(国家一类抗癌新药参一胶囊)进行II、II、IV期临床疗效观察 [35-39]。II-IV期临床试验研究共观察了2393例住院癌症患者,包含肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤和卵巢癌六个病种的1138例带瘤患者,证明该药对化疗有明显增效作用,并可改善气虚证的证候和临床症状、提高肿瘤患者免疫功能、生存质量和体重,对化疗造成的白细胞下降有保护作用,同时未见明显不良反应。

2. 人参皂甙Rg3抗肿瘤作用机理的研究

近10年来,国内外学者对人参皂甙Rg3抗肿瘤转移的机理进行了大量的研究,从以下几方面提出其可能的作用机理。

2.1 人参皂甙Rg3可抑制的肿瘤细胞增殖周期

肿瘤的增殖生长与它的细胞分裂周期中ATP、DNA、RNA及蛋白质合成密切相关。王佾先、富力等研究[40]了人参皂甙Rg3体内不同剂量对S180、Heps、EAC肿瘤细胞增殖周期的作用。小鼠腹腔接种癌细胞9天后,腹腔注射人参皂甙Rg3,采用流式细胞测定法测定不同时间抽取的癌细胞,计算每份样品细胞周期各时相的细胞比率。结果表明,人参皂甙Rg3对S180和EAC,主要作用于G2-M期,可阻断细胞S-G2期及G2-M期进程,抑制癌细胞有丝分裂前期蛋白质和ATP的合成,减慢癌细胞的增殖生长速度;但对Heps细胞的增殖周期无明显抑制作用。李攻戍等研究[17]了人参皂甙Rg3对高转移肺癌PG细胞增殖周期的影响。取生长良好的PG细胞,消化调整细胞数一致,分别接种1ml置入50ml培养瓶中,设高、中、低三个剂量组,加入细胞生长液,置于含5%CO2,37℃恒温培养箱中贴壁培养,待细胞生长至培养瓶60-70%时,更换培养液并加试验用药,对照组用生理盐水,培养3天后,弃去含药培养液,换用细胞维持液继续培养24小时后用0.25%胰酶消化,吹打成单个细胞,PBS洗涤二次,每次离心5分钟(1000rpm)。以70%冷乙醇固定18-24小时,洗去乙醇,用终浓度20μg/ml 的RNA酶在37℃水浴作用30分钟,加入PI染液500μl,4℃避光染色30分钟,用流式细胞仪测定。结果显示,人参皂甙Rg3对PG细胞增殖周期具有抑制作用,主要将其阻断在G2-M期,与对照组相比有统计学意义(P<0.01)。

2.2人参皂甙Rg3可诱导肿瘤细胞凋亡的作用及其机理

富力、鲁岐(1998)[40]在诱导肿瘤细胞凋亡的试验中证实,小鼠口服人参皂甙Rg3 3.0mg/kg 2、4、8、24小时后,EAC细胞凋亡率分别为3.25%、5.13%、4.26%和10.08%;它对不同细胞系的凋亡率不同,口服3mg/kg 2小时,对S180、Heps和EAC的凋亡率分别为19.64%、5.26%和2.96%。

高船舟、杨佩满等[41-44]比较研究了人参皂甙Rg3与阿霉素(ADM)对白血病K562/ ADM多耐药细胞株细胞凋亡的诱导作用和其对ADM诱导凋亡的影响。在相同浓度下(5.0mg/ml),Rg3诱导K562/ADM细胞凋亡的作用强于ADM,其给药后24和48小时的细胞凋亡率分别为2.34%±0.99、3.94%±0.25和4.65%±0.22、9.36%±0.61。Rg3 5.0mg/ml与ADM 15.0mg/ml协同作用24和48小时后,诱导K562/ADM细胞的凋亡率分别为44.30%±0.76和57.26%±0.79,比对照组分别高出3.3倍和4.5倍,并对Rg3有时效和量效依赖性。透射电子县委镜下可见凋亡的K562/ADM细胞的突起减少、变短,胞体出现的发芽、出泡现象,核内染色质边集、聚集成块状并项细胞膜扩散;染色质随胞体的发芽、出泡一同形成凋亡小体与细胞脱离。

2.3 人参皂甙Rg3可抑制肿瘤细胞的浸润

恶性肿瘤的浸润,是其侵袭生长、扩散和转移的特有形式和途径。癌细胞完成转移,必需穿过正常组织的细胞或细胞外基质,尤其是穿过血管内壁基底膜。研究发现,人参皂甙Rg3是目前发现的人参皂甙类成分中抗浸润活性最显著的成分,从而使它在抗肿瘤转移中发挥重要作用。

2.3.1人参皂甙Rg3对肿瘤细胞浸润单层细胞膜的抑制作用及其机理

Shinkai[45-47](1996)采用单层细胞穿越模型研究了人参皂甙类成分对肿瘤细胞浸润的影响。将肿瘤细胞接种到培养好的间质或内皮细胞的单层细胞膜上,肿瘤浸润的能力以穿过单层膜的细胞数表示。结果表明,人参皂甙Rg3[指20(S)-Rg3]能明显抑制小鼠腹水肝癌细胞(MM1)B16 FE7黑色素瘤细胞、人小细胞肺癌(OC10)和人胰腺癌(PSN-1)细胞的单层细胞浸润25mM浓度下对上述癌细胞的抗浸润率分别为89.0%73.7%84.2%59.1%;在同一剂量下对油酰磷脂酸(LPA )诱导的上述癌细胞浸润的抑制率分别为93.8%89.0%90.0%89.0%。抗浸润机理研究证实[45-46,49-50]人参皂甙Rg3能抑制化学诱变剂LPA诱导的肿瘤细胞的浸润主要是通过剂量依赖性抑制LPA导致的Ca2+ 的细胞内流上升干扰了磷脂引发的信息传导途径,即间接地干扰了由rho-P21途径激活而刺激蛋白质酪氨酸磷酸化的过程,但对LPA诱导的蛋白质酪氨酸磷酸化无直接影响。尤其有意义的是该研究发现人参皂甙Rg320(R)-构型立体结构而产生特殊的抗浸润活性其他结构相似的皂甙,包括20(S)-人参皂甙Rg3、人参皂甙Rb220(R)-Rg2的抗浸润作用较弱, 人参皂甙Rh1Rh220(R)-Rh1Rb1Rc、Re则无抗浸润活性。

2.3.2 人参皂甙Rg3体外对高转移肺癌细胞浸润血管内壁基底膜的抑制作用

李攻戍(2000)等[17]对人参皂甙Rg3对高转移肺癌PG细胞对血管内壁基底膜的迁移作用的影响进行了研究。在24孔培养板内加入0.1%BSA—1640培养基,每孔600μl,以0.25%胰酶消化收集对数生长期的PG细胞,悬浮于含0.1%BSA—1640培养基中,终浓度为2×106。将细胞悬液加到Transwell小室中,每小室100μl。将小室浸于24孔板的条件培养基中,37℃,5%CO2孵箱内孵育6小时。Transwell取出,滤膜用甲醇固定1分钟。HE染色,苏木精染色3分钟,水洗。伊红染色10秒钟,水洗。用棉签擦掉未穿过膜的细胞,用Eukitt将膜封于载玻片上,于400倍显微镜下计数侵袭细胞数。每膜计数上下左右中5个不同视野的透过细胞数。抑制率=[(对照组侵袭细胞数-给药组侵袭细胞数)/对照组侵袭细胞数]´100%。研究结果表明,Rg3对PG细胞向基底膜的迁移具有抑制作用,其抑制率与浓度梯度具有相关性,浓度越高,抑制率越高。Rg3药物浓度为50、100、250、500μg/ml时,其抑制肿瘤细胞对血管内壁基底膜的抑制率分别为59.2%、80.1%、90.1%、95.6%。

2.4 人参皂甙Rg3可抑制肿瘤细胞的粘附

肿瘤转移的发生与其细胞的粘附性关系密切。在肿瘤原发灶中,其细胞粘附性降低而活动性增高,原发瘤可产生许多降解酶,如胶原纤维酶、弹力纤维酶及其他中性降解酶,使肿瘤细胞容易脱落,离开原发灶而侵入周围组织,最终进入淋巴系统或血液而想远处转移。当瘤栓出现于远离原发灶的毛细血管中时,肿瘤细胞需要粘附并穿过内皮层才能生长为继发肿瘤。当癌细胞浸润时,需先表面手体识别层连蛋白、纤维连接蛋白,进而附着于细胞外基质胶原蛋白上,才能不被清除而具有侵袭性[47,51]

Mochizuki[20] (1995)在对C57BL/6小鼠B16-BL6黑色素瘤肺转移体外试验中发现,人参皂甙Rg3可明显抑制B16-BL6黑色素瘤对细胞基质层连蛋白及纤维连接蛋白的粘附性,并具有剂量依赖关系,而其他人参皂甙却无明显作用。杨威(2000)[28]在体外粘附试验中也证实人参皂甙Rg3能明显抑制BTT739膀胱癌细胞对纤维粘连蛋白的粘附,其在3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400mg/ml浓度范围内,对肿瘤粘附力的抑制率分别为39.7%、42.9%、47.4%、55.8%、65.2%、76.9%、80.0%、89.4%。

2.5 人参皂甙Rg3可抑制肿瘤新生血管的形成

新生血管形成是恶性肿瘤生长和转移的重要病理过程。肿瘤细胞具有诱发新生血管生成的生物学特性,肿瘤细胞可产生肿瘤血管生成因子(TAF),从宿主诱发毛细血管生成,使肿瘤细胞供血丰富,有利于肿瘤的增殖;而血管的增生也为肿瘤转移提供了条件,肿瘤细胞可以通过不出呢果树的毛细血管进入血流形成转移。因此,阻断肿瘤新生血管生成的病理过程,成为本世纪临床肿瘤抗转移治疗的新靶点。在美国已有20种抗血管生成的新药制剂在进行I-III期临床试验研究[53-56]其中,对人参皂甙Rg3抑制肿瘤新生血管及其作用机制的研究,已成为国内外学者深入探讨该化合物抗肿瘤转移机理的研究热点。

 

2.5.1 Rg3体内对肿瘤新生血管形成的抑制作用

Mochizuki M等还报道[20],在肿瘤细胞血管化的体内研究中,肿瘤接种后给以人参皂甙Rg3发现肿瘤大小不变,而向肿瘤方向生长的血管数显著减少。实验中,每组三只小鼠在背部二处皮内接种B16-BL6黑色素瘤,各组均在肿瘤接种后第1,2,3,4天静脉注射100ug/200ug或口服300ug/400ug人参皂甙Rg3。末次给药第三天,各组动物静脉注射1%的埃文蓝溶液后立即处死,分离皮肤与皮下组织。利用解剖显微镜计数向瘤体生长的血管数目。肿瘤体积通过测量接种瘤细胞的径轴来确定。所有测量均由一位观察者以单盲法完成。实验结果表明,人参皂甙Rg3连续给药可显著抑制肿瘤诱导的新生血管形成,但并不抑制肿瘤的生长。此外,人参皂甙Rg3口服或静脉注射均具有血管形成抑制作用。这些结果表明20(R)- 和 20(S)-人参皂甙Rg3具有抑制肿瘤肺转移的作用,其抗转移作用与抑制肿瘤细胞的粘附和浸润以及抗血管形成作用有关。

李茂德、陈大富、赵扬冰 [19,56-59] 研究了人参皂甙Rg3对裸鼠原位移植的人体浸润性导管癌乳腺癌微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。他们将15只原位移植了人体浸润性导管癌乳腺癌的雌性裸鼠随机分成3组:Rg3组、环磷酰胺(CTX)组和对照组[1%羧甲基纤维素钠(CMC],分别用Rg3CTX1%CMC混悬液灌胃56天,处死后病理标本用免疫组化方法检查。观察到Rg3组的MVDVEGF表达明显低于对照组(p<0.05),表明Rg3能抑制人体浸润性导管癌乳腺癌移植瘤的新生血管形成,可能与其肿瘤内VEGF表达减少有关。

潘子民、叶大风、谢幸等[59-64]研究了人参皂甙Rg3体内抗卵巢癌血管形成的作用。他们建立了荷卵巢癌的严重联合免疫缺陷(SCID)鼠腹腔转移瘤模型,将试验分为3组。空白组:SCID鼠荷瘤后不干预;对照组:荷瘤SCID鼠予磷酸盐缓冲液(PSB)灌胃;试验组:荷瘤SCID鼠予人参皂甙Rg3 PSB混悬液灌胃。分别采用逆转录聚合酶链反应技术、脉联免疫吸附法、免疫组织化学法检测三组荷瘤SCID鼠血管内皮生长因子(VEGF)mRNA、蛋白及微血管密度(MVD)。结果证实:人参皂甙Rg3处理后,荷瘤SCID鼠体内无腹水形成,腹腔中肿块播散减少;Rg3组肿瘤组织VEGFmRNA表达的相对量为119±16,显著低于空白组(254±4)和对照组(273±44),p均<0.05;Rg3组血中VEGF蛋白表达量为(14.6±0.7)pg/ml,显著低于空白组(18.5±2.1)和对照组(20.5±1.7)pg/ml,p均<0.05;Rg3组肿瘤组织中MVD为(43±7)个/mm3,显著低于空白组(65±12)个/mm3和对照组(73±10)个/mm3,p均<0.05。该研究结论:人参皂甙Rg3的通过下调肿瘤VEGFmRNA及蛋白的表达量,阻滞肿瘤血管的生成,从而抑制肿瘤生长和转移。

2.5.2 Rg3体外对鸡胚尿囊膜新生血管形成的抑制作用

李攻戍等(2000)[17]利用鸡胚尿囊膜新生血管模型对人参皂甙Rg3的抗新生血管形成作用进行了研究。选用新鲜的受精率在90%以上的白皮来航鸡种蛋,在37.6±0.2℃、60%湿度的隔水式恒温孵箱内孵育。鸡胚孵育第七天时,照卵灯下寻找胚头,在鸡胚绒毛尿囊膜体表投影距胚头1cm2大小的开窗位置,无菌条件下,用解剖针在鸡胚气室端扎一小孔并穿透气室壳膜。在开窗位置用牙科砂轮磨切蛋壳,揭去窗口的蛋壳,去除蛋壳膜,暴露绒毛尿囊膜,制备出假气室;透明胶带封闭窗口,继续孵育;鸡胚孵育满8天时,以甲基纤维素盘载20μl药液避开胚头,置于尿囊膜上,以透明胶带封闭窗口,继续孵育,第12天剪去封闭鸡胚假气室的透明胶带,注入丙酮甲醇等量混合固定液,室温静置20分钟后,剪取带有假气室一侧的蛋壳,放入丙酮甲醇混合固定液中后固定20分钟,直至绒毛尿囊膜上血管中的血液凝固;用眼科弯镊从蛋壳上剥离CAM膜,平铺在滤纸上,以数码相机拍照记录保存。在解剖显微镜下常规记录结果,血管形成评定方法:空斑区为无血管区,直径≥4mm为阳性(+),直径>6mm为强阳性(++),总鸡胚数量为168个,每组≥20个。实验结果表明Rg3具有抑制鸡胚尿囊膜新生血管形成的作用,尤其以高剂量组明显,抑制率达70.0%,组间有统计学意义(P<0.05)。

上海第二军医大学高勇、王杰军、许青等(2001)[66-70]采用鸡胚CAM和小鼠Lewis肺癌模型及免疫组化法,研究Rg3抑制肿瘤新生血管形成的机制。结果证明,Rg3浓度为0.1mM、0.5mM时,抑制鸡胚CAM的血管指数(BI)分别达到62.4%、45.6%;小鼠接种Lewis肺癌,隔天灌胃给予Rg3,20天后观察到Rg3给药组的肿瘤新生血管数明显减少,免疫组化证实Rg3可明显抑制肿瘤组织内bFGF的表达。

2.5.3 Rg3临床对人体甲状腺癌血管生成的抑制作用

刘力伟、叶国超(2003)[71-73]18例手术前两周口服Rg3的甲状腺癌患者进行了血管生成抑制作用的临床观察研究,结果证实,Rg3组甲状腺癌患者的微血管密度(MVD)为108.69±25.24,p<0.001,明显低于对照组(160.52±47.45),说明Rg3确实具有抑制甲状腺癌血管生成作用;同时发现,甲状腺癌原发瘤的长径越长,其组织的MVD值越大,提示甲状腺癌的生长与其他实体瘤一样存在血管依赖性。

2.6人参皂甙Rg3可促进一氧化氮(NO)生成的作用

韩国Kim Y.等报道[74],人参皂甙Rg3可减轻谷氨酸盐诱导的神经毒性。细胞经过量谷氨酸盐处理后引起广泛的乙溴醋胺性死亡,细胞经人参皂甙Rg3预处理后可显著降低谷氨酸盐诱导的乙溴醋胺性细胞损伤。NO可通常引发神经毒性,人参皂甙Rg3抑制过量NO的产生,保持谷氨酸盐细胞内超氧化歧化酶的浓度。丙二醛是脂质过氧化的产物,人参皂甙Rg3可抑制丙二醛的形成,减少钙离子内流。研究结果提示,人参皂甙Rg3对体外培养的皮质细胞具有神经保护作用,因此可防止过量谷氨酸盐诱发的过氧化作用产生的神经损伤。Fan等[75] 发现人参皂甙Rg3可增强干扰素激活的巨噬细胞或巨噬细胞株RAW264-7的NO产生能力,并可增强与非粘附的脾细胞共同培养的巨噬细胞的NO的生成。NO是一种自由基,其生物效应多数是通过受体介导的,具有减低细胞内游离钙、扩张血管、抑制血小板聚集和粘附的作用[76,77]]。而血小板的聚集与肿瘤转移密切相关,NO可诱导细胞凋亡[78-80]

2.7 人参皂甙Rg3可降低细胞内Ca+2离子浓度的作用

增高的细胞内Ca+2离子浓度被认为与肿瘤的侵袭性密切相关的。Imamura等[81] 在体外试验中发现高侵袭力的细胞克隆腹水肝肿瘤细胞MM1的侵袭作用需要血清的存在。在MM1细胞悬液中加入血清,可赶边细胞外的PH值并提高细胞内Ca+2离子浓度。而血清加入到低侵袭力的细胞克隆液中则不会导致细胞外的PH值和提高细胞内Ca+2离子浓度。已有研究证实[78]致癌物铃蟾素(Bombesin)可提高细胞内Ca+2离子浓度。有研究表明82],人参皂甙Rg3对预处理MM1细胞后,可使由溶血卵磷脂所引起的细胞内Ca+2离子浓度高峰消失。

2.8 人参皂甙Rg3可抑制逆转肿瘤细胞耐药性的作用

高船舟、杨佩满等[40,42]研究了人参皂甙Rg3对K562/ ADM多耐药细胞株逆转化疗药物耐药性(MDR)机制。应用用荧光分光光度仪测定K562/ ADM细胞内ADM的浓度;用流式细胞仪检测细胞凋亡率和表达P-170糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp)的K562/ ADM的细胞含量。结果表明:Rg3具有逆转mdr-1/Pgp介导的化药耐药性。Rg3可明显提高K562/ADM细胞内阿霉素(ADM)浓度,而且随Rg3浓度的提高,肿瘤耐药性细胞(K562/ADM)内ADM浓度增大,当Rg3浓度50mg/ml(低毒剂量)时,K562/ADM细胞内的ADM浓度达到甚至超过对应敏感株K562细胞的药物浓度,即K562/ADM细胞对ADM的敏感性已接近和超过K562对ADM的敏感性。所以,Rg3具有逆转K562/ADM细胞对ADM的抗性,即细胞重新获得对药物的敏感性,但表达P-170的细胞比例无明显减少,这与过度表达P-170的肿瘤细胞钙通道抑制剂——异博定(Verapamil,Ver)抑制P-170“药泵”功能的试验结果相吻合。该试验证明Rg3逆转肿瘤细胞的化药耐药性是阻断或抑制能量依赖性药物外排泵的功能,提示Rg3在逆转MDR中有钙离子通道抑制剂作用。

Kim等(2003)[83]应用MDR体外和体内模型,观察了人参皂甙Rg3逆转p-糖蛋白介导的多药耐药性。Rg3呈剂量依赖性地促进罗丹明123在耐药细胞株KBV20C中的积累,但对亲代KB细胞无影响;Rg3还能抑制KBV20C细胞中[3H]标记的长春碱外流及逆转对阿霉素、COL、长春新碱和依托泊甙的多药耐药性;应用RT-PCR和免疫印迹法分析Rg3 处理过的KBV20C细胞表明,Rg3既不是通过抑制MDR-1基因表达,也不是通过抑制P-糖蛋白(Pgp)水平来抑制药物外流的。[3H]azidopine的光亲和标记分析揭示 Rg3与azidopine竞争的糖蛋白结合Pgp区域去,说明Rg3能与抗癌药物竞争与Pgp的结合,由此阻断药物外流。

2.9 人参皂甙Rg3可抑制激活环激酶抑制剂

香港中文大学LIU WK教授等报道[84],在一项人参皂甙抗肿瘤研究中,人参皂甙Rg3LNCaP人前列腺癌细胞具有抑制增殖作用。这种癌细胞在与250mM人参皂甙共同培养48小时后失去粘附作用。生物标记基因包括前列腺特异性抗原(PSA)、雄激素受体(AR)和5-a还原酶的表达以及增殖细胞核抗原(PCNA)均受到抑制。经荧光显微镜、流式细胞仪和反转录多聚酶链反应证明,人参皂甙Rg3诱导典型的细胞凋亡形态,并干拢LNCaP细胞中凋亡相关基因bcl-2和caspase-3的表达。综合这些结果显示,人参皂甙Rg可激活环激酶抑制剂P21和P27的表达,使LNCaP细胞滞留在G1期,进而通过caspase-3介导的细胞凋亡抑制细胞的增殖。

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