人参皂苷Rh2对白血病H L60细胞生长的调节作用

发布日期:2020-11-05 14:16:57     浏览次数:3

摘要:目的:观察人参皂苷R h2对人白血病细胞株H L60增殖及凋亡的调节作用。方法:利用流式细胞术检测白血病细胞株H L60在人参皂苷R h2处理过程中细胞增殖周期的改变及凋亡发生的情况;另一方面通过动物实验,将药物处理前后的细胞株注射裸鼠,验证该药物是否能够有效抑制H L60细胞在动物体内的恶性增殖及白血病症状。结果:药物处理后的H L60细胞在G 1 期比例降低,S期比例显著升高(P<0.05),药物处理后H L60细胞早期及中晚期细胞凋亡率为40% 左右,明显高于未处理组H L60细胞,人参皂苷R h2通过介导S期阻滞作用从而使H L60细胞进入凋亡程序。通过动物实验证明了人参皂苷R h2能够抑制H L60细胞在体内的恶性增殖。结论:人参皂苷R h2能够抑制人白血病细胞株H L60的恶性增殖并促进其发生凋亡。人参是中医药传统的补气要药,以其攻补兼施、毒副作用小或无、注重整体的优越性已得到广泛认可。人参皂苷单体R h2是从红参中提取的天然活性成分,具有很高的抗肿瘤活性。以人白血病H L60细胞株为受试对象,研究人参皂苷单体R h2对H L60细胞增殖和凋亡的影响,为进一步阐明人参皂苷单体抗白血病作用的机制,使其应用于白血病的临床治疗提供更多的实验依据。

材料与方法

1. 材料

1.1 细胞培养 H L60细胞为第二军医大学医学发育生物学中心馈赠,用含10%小牛血清(杭州四季青生物公司)的R PM I1640(Gibco)在37℃、5%CO 2 的培养箱中培养。细胞培养板、培养瓶、培养皿(FALCON,BD)。1.2 人参皂苷Rh2配液 人参皂苷Rh2(购置上海同田生物技术有限公司)溶于PBS(pH 值7.4)中配成50g/L母液,超滤除菌,-20℃保存备用。用R PM I1640配成所需工作浓度50m g/L,4℃保存备用。1.3 动物 BA LB/c Nu品系裸鼠共24只,3-5周龄,雌雄各半,体质量约15-25g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,合格证批号为SXCK(沪)2007-0005。

2. 方法

2.1 观察人参皂苷单体Rh2对细胞生长的抑制作用 取对数生长期细胞制成细胞悬液,浓度1×10 4 /m L,接种于24孔培养板内,每孔1m L。6h后加入不同浓度的人参皂苷单体R h2,使终浓度分别为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00m g/L,每一质量浓度组均设4孔。12、24、36、48、60、72h,每次取3孔细胞,轻轻吹打均匀,血细胞计数板(密理博细胞计数器)计数,每孔数3次,计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=[1-(处理组细胞绝对数/对照组细胞绝对数)] ×100% 。

2.2 细胞凋亡检测 分别收集未处理组H L60细胞和药物处理组H L60细胞,每组约为2×10 5 个细胞,离心去上清,加入100μL PBS。室温避光孵育30m in后,2m L PBS洗涤2遍,加入400μL PBS,上机检测前5m in加入5μL PI(50μg/μL)。流式细胞仪LSRⅡ(BD Biosciences)计数10 000个细胞,检测细胞凋亡。

2.3 细胞周期测定 收集未处理组H L60细胞和工作浓度药物处理3d后H L60细胞,每组约为1×10 6 个细胞,至离心管中,离心去上清后加入70% 乙醇,混匀,4℃固定24h。将固定过的细胞用PBS洗2遍,加入100μL PBS,混匀。加入50μL R NA酶(1m g/m L)37℃消化30m in,各管再加入400μL PBS并将细胞液转入相应流式管中,上机前5m in各管加50μL PI(250μg/μL),混匀。流式细胞仪计数10 000个细胞,检测细胞周期分布;分析软件采用M odfit LT 3.0。

2.4 在体裸鼠动物实验 BALB/c Nu品系裸鼠共24只,随机分为3组。收集药物处理后的H L60细胞和野生组H L60细胞,每组取2×10 5 细胞,离心去上清,加入200μL PBS,取1m L注射器抽取细胞悬液注射入裸鼠腹部皮下。SPF级喂养,每日观察。各组裸鼠分别于注射细胞后1个月颈椎脱臼活杀,观察组织和器官的颜色、光泽、质地、有无结节等。分别取肺脏、肝脏、肾脏、脾脏等组织器官,福尔马林固定后H E染色进行病理学检查。2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行数据分析,总体采用方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1. 人参皂苷R h2对H L60细胞生长的抑制作用 人参皂苷R h2可明显抑制H L60细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性,最适药物浓度为50μg/m L、时间为72h对细胞增殖影响变化最明显,药物处理组细胞的生长抑制率达42.5% 。

2. 人参皂苷R h2对H L60细胞周期的影响 工作浓度药物处理细胞3d后进行流式细胞周期检测,图1结果显示对照组G 1期细胞占72.85% 、S期细胞占20.76% 、G 2 期细胞占6.39% 。药物处理组G 1 期细胞占38.32% 、S期细胞占55.97% 、G 2 期细胞占5.71% 。两组试验数据方差分析结果为:P=0.000<0.05,提示人参皂苷R h2可介导H L60细胞发生S期的阻滞作用。3. Annexin V-FITC/PI双染色法流式细胞检测细胞凋亡:从图2双标记的流式散点图上显示:左下象限是活细胞,即FITC-/PI-;右上象限是坏死细胞和凋亡晚期细胞,即FITC+/PI+;右下象限是早期凋亡细胞,即FITC+/PI-;通过分析计算可得到各类型细胞的比例。流式结果显示药物处理后坏死细胞和凋亡晚期细胞占总细胞比例的40.80% ,早期凋亡细胞占总细胞比例的41.99% ,而未处理组H L60细胞坏死细胞和凋亡晚期细胞占总细胞比例的6.00% ,早期凋亡细胞占总细胞比例的7.45% ,两组实验数据方差分析结果P=0.000<0.05,提示人参皂苷Rh2能够促进H L60细胞发生凋亡。

4. 动物一般情况观察 观察发现,注射未处理H L60细胞株组的裸鼠与注射人参皂苷R h2处理后的H L60细胞株及对照组裸鼠相比,注射1-2周开始消瘦并且不爱运动。8周后开始

活杀裸鼠,并进行全面的大体解剖检查,发现注射了未处理组H L60细胞株的裸鼠脾脏均有不同程度的肿大增生情况。肿大的脾脏表面光滑,质地柔软。而注射了药物处理后H L60细胞株的裸鼠脾脏增生较弱。

5. 各脏器病理检查 注射了未处理组H L60细胞株的裸鼠的脾脏、肝脏、肺脏和肾脏等器官有明显的炎症、肿胀、充血和大量淋巴细胞浸润现象,有坏死发生。见图3-图6。在图3B中可见大量淋巴细胞浸润,脾正常结构破坏;在图3C中可见淋巴小结大量增生,但脾基本结构尚存,可见白髓、红髓。在图4B中可见肝细胞肿胀,部分肝细胞气球样变,点状和灶性坏死,肝窦充血;图4C中肝索结构尚存,血窦充血较轻,可见少量淋巴细胞浸润。在图5B中可见,肺泡壁大面积充血水肿,其间有大量淋巴细胞浸润,且伴有纤维增生;图5C中有少量肺泡壁充血,浸润现象不明显。在图6B中可见,肾小管壁大面积充血水肿,其间有大量淋巴细胞浸润,且伴有纤维增生;图6C中有少量肾小管壁充血,浸润现象不明显。

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