人参皂甙 Rg3 在体外对白血病 K562 细胞增殖和诱导分化的影响

发布日期:2020-12-15 10:31:55     浏览次数:7

摘要

背景:文献报道人参皂甙 Rg3 具有抗肿瘤作用,但对白血病作用研究很少。

目的:观察人参皂甙 Rg3 对白血病 K562 细胞的作用,并探讨其相关机制。

方法:以白血病 K562 细胞为靶细胞,实验分为对照组和人参皂甙 Rg3 组,人参皂甙 Rg3 组分别添加 10,20,40,80,100 mg/L Rg3。

结果与结论:MTT 检测结果显示,不同浓度人参皂甙 Rg3 组 K562 细胞生长抑制率均显著高于对照组(P < 0.05~0.01)。NBT结果显示,人参皂甙 Rg3 组培养 1,2,3 d K562 细胞还原率均高于对照组(P < 0.01);人参皂甙 Rg3 组部分 K562 细胞体积变小,核仁消失,同时阳性细胞增多,细胞向成熟分化;流式细胞仪检测显示人参皂甙 Rg3 组培养 2 d 细胞周期 G 2 期增高了 3.84 倍。提示人参皂甙 Rg3 在体外可抑制 K562 细胞增殖活性,其机制可能与人参皂甙 Rg3 将 K562 细胞周期阻滞在G 2 期,使细胞不能进行正常的有丝分裂,从而抑制细胞增殖有关。

关键词:人参皂甙 Rg3;K562 细胞;硝基蓝四氮唑蓝;增殖;诱导分化doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.19.028

缩略语:NBT:nitroblue tetrazolium,硝基四氮唑蓝肖凤,刘彬,张建平,王伴青,方木水,胡玮,孙续禄,朱清仙. 人参皂甙 Rg3 在体外对白血病 K562 细胞增殖和诱导分化的影响[J].中国组织工程研究,2012,16(19):3556-3559.

0 引言

白血病是一种造血系统恶性肿瘤,病因尚未完全明了,到目前为止,白血病的治疗仍以传统的大剂量联合化疗为主,但大部分化疗药物对患者免疫系统产生较大的破坏,而且可能在白血病的基础上增加患第二种肿瘤的可能性 [1] 。因此,对于恶性肿瘤这一细胞增殖周期障碍性疾病,寻找新的以细胞周期作为抗癌靶点且对机体不良反应小的药物成为当务之急。近年研究发现,从人参中提取的皂甙单体成分Rg3有显著的抗肿瘤作用,且对骨髓、心、肺、肝、肾和神经系统无毒副作用。其中20(R)-人参皂甙Rg3(简称人参皂甙Rg3)的抗肿瘤作用最为明显 [2-3] 。实验探讨人参皂甙Rg3对K562细胞增殖、分化及其细胞周期的影响,为发现与寻找中药调控白血病细胞增殖、分化或凋亡的机制奠定基础。

1 材料和方法

设计:细胞学体外实验。

时间及地点:实验于2010-10/2011-02在

江西省消化疾病研究所完成。

肖凤,等 . 人参皂甙 Rg3 在体外对白血病 K562 细胞增殖和诱导分化的影响

ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH3557

南昌大学医学院,江西省南昌市330006;2 井冈山大学医学院,江西省吉安市343000肖凤★,女,1965年生,江西省吉安市人,汉族,2005年南昌大学毕业,硕士,教授,主要从事肿瘤发生机制及肿瘤复发与转移的研究。xiaofeng1008@yahoo.com.cn通讯作者:朱清仙,教授,南昌大学医学院,江西省南昌市 330006中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:1673-8225(2012)19-03556-04

收稿日期:2011-12-11

修回日期:2012-03-05

(20110411008/WL·S)

材料:

主要试剂及仪器:

实验方法:

靶细胞和细胞培养:K562细胞用含体积分数为10%小牛血清的完全1640培养液培养于37 ℃、体积分数为5%CO 2 细胞培养箱中,细胞浓度为1×10 9 L- 1 。每天观察细胞的生长状态,当细胞密度增大、培养液颜色变黄时,便需更换新鲜培养液;先将细胞悬液收集至无菌离心管,低速离心1 000 r/min,5 min,弃上清,再加入适量含体积分数为10%小牛血清的完全1640培养液,继续培养。细胞传代:先将细胞悬液收集至无菌离心管中,低速离心1 000 r/min,5 min,弃上清,加入适量含体积分数为10%小牛血清的完全1640培养液,重悬细胞,然后分别接种于2个25 mL螺口培养瓶中,继续培养。具体步骤参见文献[4-5]。MTT法检测细胞生长抑制率 [6-7] :K562细胞接种于96孔板,浓度为1×10 9 L- 1 ,实验分为2组,对照组正常培养,人参皂甙Rg3组分别加入10,20,40,80,100 mg/L Rg3,培养1,2,3 d,每孔加入MTT溶液100 μL继续孵育4 h。吸弃上清液,加入DMSO 100 μL/孔,作用30 min,在酶标仪570 nm处读取吸光度值(A 570nm )。计算细

胞生长抑制率。细胞形态学观察 [8] :将K562细胞以1×10 9 L- 1的浓度接种于96孔板中,分为对照组(正常培养)和人参皂甙Rg3组(80 mg/L),分别继续培养1,2,3 d。收集细胞,涂片,瑞氏染色,油镜下观察细胞形态。NBT还原能力检测 [9] :分组同上,将细胞悬液移入离心管,以1 000 r/min离心5 min,收集细胞;再将细胞悬浮于200 μL/孔的0.1%NBT溶液中,内含0.24 mg/L的对苯二甲酸,37 ℃孵育30 min后,离心去上清,沉淀涂片,胞质含蓝灰色颗粒的细胞为阳性细胞,计数200个细胞,计算NBT阳性率。流式细胞仪检测细胞周期 [10] :分组同上,收集K562细胞于10 mL离心管中,1 000 r/min离心5 min,去上清,加PBS重悬细胞,洗涤2遍;PBS洗涤后,弃上清,以残留于管底的少量液体将细胞彻底重悬,务必要防止细胞成团。加入1 mL的体积分数为70%预冷乙醇固定,移入1.5 mL EP管中,流式细胞仪检测不同时间点细胞周期各时相的比例。主要观察指标:MTT比色法测定细胞增殖活性;瑞氏染色观察细胞形态学改变,NBT还原实验观察细胞的分化指标;流式细胞仪分析细胞周期变化情况。统计学分析:由第二作者采用SPSS 12.0软件完成统计处理,实验数据以x_±s表示,组间两两比较采用LSD-t 检验,P < 0.05为差异有显著性意义。2 结果2.1 Rg3对K562细胞增殖活性的抑制作用MTT法测定人参皂甙Rg3对K562细胞的生长抑制作用,结果显示,不同浓度人参皂甙Rg3组K562细胞生长抑制率均显著高于对照组(P <0.05~0.01),见表1。2.2 瑞氏染色K562细胞形态学变化 瑞氏染

色后光镜下观察显示,对照组K562细胞多呈圆形,体积较大,核/质比例大,质少呈淡蓝色,核圆形,核仁清楚,染色质不均匀,呈不规则的粗粒或结块状。Rg3作用后,细胞体积变小,胞质增多,部分出现少量颗粒,核/质比例缩小,核仁减少或消失,胞核有凹陷,见图1。试剂及仪器  来源K562 细胞株 人参皂甙 Rg3 硝基四氮唑蓝(nitrobluetetrazolium,NBT)1640 培养基 DMSO 小牛血清 倒置显微镜(CKC-TR-2W) 流式细胞仪(FACS Calibur) 酶联免疫检测仪(550 型) 江西省分子医学重点实验室惠赠大连富生制药公司美国 Sigma 公司美国 GIBCO 公司美国 Merk 公司杭州四季青公司Olympus 公司

美国 Becton-Dickinson 公司美国 BIORAD 公司表 1 各组 K562 细胞的生长抑制率Table 1 Growth inhibition rate on K562 cells in eachgroup (x_±s, n= 6, %)a P < 0.05,  b P < 0.01, vs. control groupGroup  1 d  2 d  3 dControl  10.12±1.13 12.25±1.55  14.40±2.50Ginsenoside Rg310 mg/L  11.34±2.16 14.18±4.04  31.11±3.40 a20 mg/L  15.64±3.3533.70±5.26 a 34.12±4.57 a40 mg/L  30.21±4.03a40.67±4.44 b 39.15±4.54 a80 mg/L  39.12±3.28b50.04±6.21 b 39.25±5.73 a细胞生长抑制率(%)=(对照组A 570 nm -人参皂甙Rg3组A 570nm )/对照组A 57nm ×100%NBT阳性率=(NBT阳性细胞数/细胞总数)×100%肖凤,等 . 人参皂甙 Rg3 在体外对白血病 K562 细胞增殖和诱导分化的影响P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com3558

2.3 Rg3对K562细胞分化的影响 NBT结果显示,人参皂甙Rg3组培养1,2,3 d K562细胞还原率分别为12.2%,15.6%,15.1%,均高于对照组5.8%(P < 0.01)。阳性细胞增多,同时细胞向成熟分化。2.4 Rg3对K562细胞的细胞周期影响 流式细胞仪检测培养2 d的细胞,结果显示,对照组细胞G 1 期为32.45%,S期为63.99%,G 2 期为3.56%,表明K562细胞处于增殖旺盛状态。Rg3组细胞G 1 期为40.33%,S期为46%,G 2 期为13.67%,与对照相比,人参皂甙Rg3组K562细胞的G 2 期比对照组增高了3.84倍,提示Rg3作用K562细胞2 d时,能将细胞周期阻滞在G 2 期,使部分细胞不能进行正常的有丝分裂,从而抑制了K562细胞的增殖,见表2,图2,3。

3 讨论

化疗是目前白血病的主要治疗手段,但化疗所带来的不良反应及耐药成为治疗过程中的难点 [11] 。而诱导分化治疗的基本特点在于不直接杀伤肿瘤细胞而是诱导其分化为正常或接近正常的细胞,避免了常规放、化疗具有良好的临床应用前景 [12] 。从中草药中寻找抗癌药物将为癌症的化学预防和分化治疗提供另外一条途径。实验通过MTT法测定结果显示,人参皂甙Rg3对白血病细制率明显高于对照组(P < 0.05~0.01);其中80 mg/L人参皂甙Rg3组抑制最明显。本实验揭示了人参皂甙Rg3在体外对白血病细胞株具有细胞毒作用,能够抑制白血病细胞株的增殖。细胞分化表现在形态和功能两个方面,形态分化是细胞分化的重要标志,能客观反映诱导分化剂对细胞的诱导分化作用 [13] 。在人参皂甙Rg3作用下K562细胞形态学有趋向成熟改变,瑞氏染色可见细胞体积缩小,细胞核也缩小,核仁消失,染色质增粗,胞质增多,核偏于一侧,有凹陷和分叶等。而NBT还原反应实验是目前公认的一个反映细胞分化的敏感指标 [14] 。经人参皂甙Rg3作用后,大部分NBT还原率均有不同程度的增高,表明Figure 2 K562 cell cycle phase in the control group afterculture for 2 d图 2 对照组 K562 细胞培养 2 d 细胞周期时相图Figure 1 Effect of 80 mg/L ginsenoside Rg3 on differentiationof K562 cells (×40)图 1 80 mg/L 人参皂甙 Rg3 对 K562 细胞分化的影响(×40)a: Controlgroupc: Ginsenoside Rg3 culture 2 dgroupb: GginsenosideRg3cultur1 d groupd: Ginsenoside Rg3 culture 3 dgroup

表 2 Rg3 处理 K562 细胞后不同时间细胞周期时相分布Table 2 Cell cycle phase distribution after ginsenoside Rg3treatment (%)细胞发生了分化和功能的恢复,其中人参皂甙Rg3组1,2,3 d均明显高于对照组。因此,进一步说明人参皂甙Rg3有诱导K562细胞向分化成熟的趋势。人参皂苷Rg3主要作用于细胞增殖周期的G 2 /M期,诱导肿瘤细胞凋亡,是一种很有效的、通过诱导细胞凋亡而杀死肿瘤细胞的抗肿瘤药物 [15-16] 。实验检测了Rg3处理后K562细胞的细胞周期变化情况。结果发现,Rg3处理K562细胞2 d时,其G 2 期比对照组增高了3.84倍,表明Rg3将细胞周期阻滞在G 2 期。G 2 期也叫DNA合成后期,在G 2 周期时相,一些与有丝分裂相关的蛋白质,如微丝、微管蛋白、有丝分裂因子等合成结束,为有丝分裂作准备,这提示Rg3阻止了细胞的有丝分裂,最终抑制了细胞的恶性增殖,这与细胞生长曲线所显示的结果相符。实验证实,Rg3对白血病细胞的增殖具有明显的抑制作用,能诱导白血病细胞从功能上向成熟细胞分化。说明Rg3具有抗白血病的作用,可能是通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化实现的。至于Rg3对K562细胞抑制增殖和诱导分化作用的具体机制还待进一步的探索。4 参考文献[1]  Zhao CH, Hou M. Baixuebing•Linbaliu. 2006;15(1):69-71.赵春红,侯明.天然药物诱导分化研究现状[J].白血病·淋巴瘤

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