人参皂苷 Rg 3 含量的变化分析

发布日期:2020-12-21 15:34:24     浏览次数:7

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HPLC 法测定三七发酵产物中人参皂苷 Rg 3 含量的变化
王青 1 ,袁萍 2 ,茅仁刚 2 ,王菊勇 1 ,郑展 1(1. 上海中医药大学附属龙华医院中医肿瘤研究所,上海 200032;2. 上海师范大学生命与环境科学学院,上海 200234)摘 要:目的:建立经真菌转化前后三七中人参皂苷 Rg 3 的含量测定方法。方法:采用 HPLC 法,色谱柱为Phenomex C 18 (250mm ×4. 6mm,5μm ),流动相为乙*** - 水,梯度洗脱;柱温30℃,检测波长为203nm,流速1. 0mL/min,进样量为 20μL。结果:人参皂苷 Rg 3 的回归方程:Y =35672013X -2413,r =0. 99992,在 0. 0019 ~0. 2488 mg/mL 范围内有良好的线性关系,平均回收率为99. 56%,RSD =1.48%(n =8)。结论:该方法简便、快捷、准确、重复性好,可用于三七发酵产物中人参皂苷 Rg 3 的含量测定。关键词:三七;人参皂苷 Rg 3 ;高效液相色谱法;含量测定中图分类号:R284. 1 文献标识码:A文章编号:1673 -7717(2011)09 -2063 -02Determination of the Content Changes of Ginsenoside Rg 3 inPanax Pseudo - ginseng Fermentation Product by HPLC
WANG Qing1 ,YUAN Ping 2 ,MAO Ren-gang 2 ,WANG Ju-yong 1 ,ZHENG Zhan 1(1. Longhua Hospital,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200032,China;
2. Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)Abstract: Objective: To establish a assay method of ginsenoside Rg 3 in Panax pseudo - ginseng before and after thefungal transformation by HPLC. Methods: A Phenomex C 18 (250mm ×4. 6mm,5μm) column served as stationary phase and acetonitrile - water in gradient elution mode as mobile phase; The column temperature was 30℃ and the detection wavelength was 203nm,the flow rate was 1. 0mL/min and the injection volume was 20μL. Results: A good linearity of ginsenoside Rg 3 was in the range of 0. 0019 ~ 0. 2488 mg/mL and r =0. 99992; The average recovery rate was 99. 56%and RSD = 1. 48% ( n = 8). Conclusion: This method is simple,fast,accurate,reproducible and can be used for de-termining the content of ginsenoside Rg 3 in Panax pseudo - ginseng before and after thefungal transformation .
Key words:Panax pseudo - ginseng; Ginsenoside Rg 3 ; HPLC; Content determination收稿日期:2011 -04 -14
基金项目:上海市科委创新行动计划项目(09140903600);上海市
教委项目(10YZ51)作者简介:王青(1983 - ),女,山东滨州人,助理研究员,硕士,研究方向:微生物药物及抗肿瘤中药的研究。
通讯作者:王菊勇(1967 - ),女,甘肃兰州人,副研究员,博士,研究方向:恶性肿瘤的临床与基础研究。E-mail:wangjuyong1@126. com。
三七(Panax pseudo - ginseng)为五加科多年生草本植物,含皂苷,主要为三七皂苷 R 1 、人参皂苷 Rb 1 、人参皂苷Rg 1 等低活性皂苷。三七与人参比较,具有价格低、易种植等特点。因此,本课题组以三七提取物为底物,进行微生物转化研究。从种植人参的土壤中分离、筛选出一株活性菌株,三七提取物经其发酵后可生成人参皂苷 Rg 3 。本文对HPLC 法进行研究,从而选择最优检测条件,准确测定发酵产物中人参皂苷 Rg 3 的含量,为微生物转化三七提取物提供实验依据。通过研究进一步提高得率,用于新药研发、工业生产等领域,将会产生很好的经济效益。1 仪器与试药

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1. 1 仪器Agilent1100 型 高 效 液 相 色 谱 仪; G1311A 二 元 泵;G1314AVWD 检测器;G1322A 在线脱气机;Agilent Chem-Station 色谱工作站;TG332A - 微量分析天平。1. 2 试剂试药1. 2. 1 试药 三七饮片购自上海雷允上药业有限公司,经上海新康制药厂常规提取、干燥得三七提取物;人参皂苷Rg 3 对照品(批号 070516)购自上海融禾医药科技有限公
司。1. 2. 2 试剂 所用流动相乙***为色谱纯;水为超纯水;其他涉及的试剂试药均为分析纯。2 方法与结果2. 1 色谱条件Phenomex C 18 柱(250mm ×4. 6mm,5μm );流动相为乙*** - 水,按表1 梯度洗脱,柱温30 o C,检测波长 203nm,流速为1. 0mL/min;进样量20μL,理论塔板数按人参皂苷 Rg 3 计算不低于 3000。3 6 0 2第 29 卷 第 9 期2 0 1 1 年 9 月中 华 中 医 药 学 刊CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINEVol. 29 No. 9Sep. 2 0 1 1中华中医药学刊表 1HPLC 流动相洗脱梯度表
时间(min) 乙***比例(%)水比例(%)0 ~24 25 ~41 75 ~5924 ~30 41 ~50 59 ~50 30 ~50 50 ~70 50 ~30 50. 01 ~70 90 10
2. 2 对照品溶液的制备
精密称取人参皂苷 Rg 3 对照品适量,置量瓶中,加入加甲醇溶解制成含人参皂苷 Rg 3 0. 2488mg/mL 的对照品溶液。2. 3 供试品溶液的制备转化前:精密称取三七提取物 50mg,加甲醇溶液溶解并定容至 10mL,摇匀,备用。
转化后:发酵液离心,取上清液,用水饱和正丁醇萃取3 次,蒸干,甲醇溶解并定容,用 0. 45μm 微孔滤膜过滤,备用。
2. 4 标准曲线的制备精密称取人参皂苷 Rg 3 对照品 6. 22mg,置 25mL 容量瓶中,加适量甲醇溶液溶解后定容至刻度,摇匀,浓度为0.2488mg/mL,作为对照品母液备用。再逐级稀释至含人参皂苷 Rg 3 对照品 0. 1244、0. 0622、0. 0311、0. 0156、0. 0078、0. 0039、0.0019mg/mL 的一系列对照品溶液,经0.45μm 微孔滤膜过滤作为供试品溶液。精密吸取上述溶液各20μL,测定,得人参皂苷 Rg 3 回归方程 Y =35672013X -2413,r =0.99992,在0.0019 ~0.2488 mg/mL 范围内有良好的线性关系。2. 5 精密度试验取配置好的对照品溶液按照上述方法依次测定,连续进样 6 次,以峰面积计算,结果人参皂苷 Rg 3 峰面积的 RSD为 0. 76%(n =6)。
2. 6 重现性试验取适量上述 2 种供试品分别按照供试品溶液的制备方法同时制成 5 份供试液,进样 20μL,以峰面积计算,转化前供试品中无人参皂苷 Rg 3 对应的峰,转化后供试品中人参皂苷 Rg 3 的含量为 1. 902%,测定结果的 RSD 为 0. 69% (n=5)。
2. 7 稳定性试验
取已配置好的 2 种供试品溶液按照上述色谱条件测定,分别于 0、2、4、6、8、10、20、40h 进样,进样体积 20μL,以峰面积计算,转化前供试品中无人参皂苷 Rg 3 对应的峰,转化后供试品中人参皂苷 Rg 3 峰面积 RSD 为 1. 27% (n = 8)说明 2 种供试品在 40h 内基本稳定。
2. 8 加样回收率实验取 6 份已知含量的供试品,精密称定,分别加入人参皂苷 Rg 3 对照品 0. 521mg,进行含量测定,结果转化前供试品中人参皂苷 Rg 3 平均回收率为 98. 91%,RSD =1. 95% (n =6),转化后供试品中人参皂苷 Rg 3 平均回收率为 99. 56%,RSD =1. 48%(n =6)。
2. 9 样品测定
在上述 2 种供试品中分别取 3 个样品按照上述含量测定方法分别测定并计算含量,结果显示,转化前供试品中无人参皂苷 Rg3 对应的峰,转化后样品中人参皂苷 Rg 3 的平均含量为 1. 902%。图 1 三七提取物 HPLC 图谱图 2 经菌株发酵后三七提取物 HPLC 图谱图 3 人参皂苷 Rg 3 对照品 HPLC 图谱
3 讨 论
3. 1 检测波长的选择
取配制好的对照品溶液进行紫外扫描,结果人参皂苷Rg 3 的最大吸收波长为 203nm,故选择 203nm 为检测波长。
3. 2 流动相的选择
实验过程中分别对文献中常用中几种流动相进行比较,选择乙*** - 水。继而用不同比例的乙*** - 水、不同梯度的乙*** - 水进行比较,结果 2. 1 所选定的梯度洗脱条件最好,且能通过峰纯度验证,故选之。
3. 3 色谱柱的选择
试验比较了 Phenomex C 18 (250mm ×4. 6mm,5μm ),Li-chrospher C 18 (250mm × 4. 6mm,5μm ),DiamonsilTM C 18(250mm × 4. 6mm,5μm )这 3 种色谱柱,结果在 PhenomexC 18 (250mm × 4. 6mm,5μm )上分离度、重现性好,效果佳,故选择 Phenomex C 18 (250mm ×4. 6mm,5μm )。
参考文献
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