人参皂苷 Rh2 对人食管癌 的影响

发布日期:2020-12-21 15:37:25     浏览次数:4

肿瘤细胞侵袭能力是肿瘤生长和转移的重要前提,深入探索肿瘤细胞的侵袭机制、广泛寻找减弱肿瘤细胞侵袭力的有效方法等一直是肿瘤学研究的热点之一。众多研究已经证实,主要由胶原蛋白、弹性蛋白、非胶原糖蛋白以及氨基多糖等大分子组成的肿瘤宿主组织细胞外基质( ECM) 和/或基膜( BM) ,作为天然屏障,在阻遏肿瘤细胞侵袭的发生和发展中发挥着极其重要的作用,而肿瘤细胞通过分泌多种丝氨酸蛋白酶以及基质金属蛋白酶( MMPs) 等来进行降解破坏宿主组织 ECM 与 BM 的过程则是肿瘤细胞侵袭和转移的关键环节[1 -5] 。组织因子途径抑制物 2( TFPI - 2) 是新近发现的一种分子量为 32 kD 的抑制丝氨酸蛋白酶的蛋白分子,属组织细胞的一种生理性基因产物,可广泛抑制包括 MMPs、纤溶酶、胰蛋白酶等在内的多种蛋白酶活性[3 -5] 。近年来的研究已经发现在各种恶性肿瘤组织内,无论是其肿瘤细胞 TFPI -

[作者简介] 岳峰( 1975—) ,男,主治医师,研究方向为肿瘤免疫学。

[基金项目] 河北省科技研究与发展计划项目( 052761010 -28)Eca -109 细胞,按 Trizol 试剂说明提取细胞总 RNA,进行 RT -PCR 扩增,扩增产物经 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳,应用 gel - pro凝胶分析软件对电泳谱带进行分析。引物序列及扩增条件见表 1。

表 1 TFPI -2 及 β - actin PCR 引物序列及扩增条件

基因 引物 退火温度/℃ 产物 /bp

β -catenin5'-CAGAATTCTATGGACCCCGCTCGCCCC -3'

5'-CAGTCGACTTAAAATTGCTTCTTCCG -3'55 708

β -actin5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG -3’

5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC -3’55 838

1. 5 TFPI -2 基因蛋白表达的检测 收集培养48 h 后的 Eca -109 细胞,常规提取细胞蛋白,Lowry 法蛋白定量; 离心取上清液进行 SDS - PAGE 电泳; 电泳完毕后电转法转印 PVDF 膜;5%脱脂牛奶封闭,加鼠抗人 TFPI - 2 和 β - actin 单克隆抗体,4 ℃静置过夜; 加辣根过氧化物酶( HRP) - 兔抗鼠 IgG,37℃孵育 1 h,DAB 显色,分析蛋白条带。结果以测定蛋白条带与 β - actin 的积分吸光度( IOD) 比值来表示 TFPI -2 蛋白的相对表达水平,每个浓度均重复 3 次。1. 6 侵袭力检测 Transwell 小室底部由孔径8 μm 的聚碳酸酯膜封闭,在膜上涂 500 mg/L 的 Matrigel 50 μL,37 ℃,30min,使之在微孔滤膜上重组为基底膜结构。以终浓度 10,40,80 mg/L 的人参皂苷 Rh2 预处理细胞 48 h,收集细胞用无血清 RPMI1640 培养液调整细胞数 1 × 10 9 L-1 ,取细胞 100μL 接种于 transwell 上室内,每组设 3 个复室,下室加入含10%胎牛血清的 RPMI -1640 培养液 500 μL,37 ℃,5% CO 2培养 24 h 后,取出小室,将滤膜上层的细胞用棉签抹去,PBS清洗,用 0. 1%结晶紫染色 10 min,清洗风干,反贴于载玻片上,100 倍光镜下计数中央和四周共 5 个视野的穿膜细胞数,求平均值,按下式计算药物对肿瘤细胞的侵袭抑制率。侵袭抑制率 = ( 1 - 实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞

数) ×100%

1. 7 统计学处理 应用 SPSS 11. 5 软件对所有数据进行统计学处理,结果以 珋 x±s 表示,2 组间均数比较用t 检验,多组间均数比较采用单因素方差分析。P <0.05 为有显著性差异。

2 结 果

2. 1 人参皂苷 Rh2 对 Eca -109 细胞 TFPI -2 mRNA 表达的影响 RT - PCR 结果显示,经不同浓度( 终浓度 10,40,80mg/L) 人参皂苷 Rh2 处理 48 h 后,Eca - 109 细胞 TFPI - 2mRNA 表达水平校正值( TFPI - 2/β - actin) 分别为 0. 206 ±0. 141,0. 492 ± 0. 109 和 0. 717 ± 0. 083,对照组为 0. 193 ±0. 075。与对照组比较,10 mg/L 组细胞 TFPI - 2 mRNA 表达水平无明显差异( P >0. 05) ,但 40,80 mg/L 组均显著高于对照组( P 均 <0. 01) ,呈现随人参皂苷 RH2 浓度增加其表达水平逐渐增强趋势。见图 1。

2. 2 人参皂苷 Rh2 对 Eca -109 细胞 TFPI -2 蛋白表达的影响 Westernblot结果显示,对照组TFPI - 2蛋白的表达值为2 基因表达活性还是其内部基质中的 TFPI - 2 蛋白含量水平,均显示出严重低下状态[2 -6] 。为探索中药有效成分提取物对肿瘤细胞 TFPI -2 基因活性表达的影响,笔者开展了人参皂苷 Rh2 对人食管癌 Eca - 109 细胞 TFPI - 2 基因表达影响的研究,现将结果报道如下。

1 实验资料

1. 1 材料 人参皂苷 Rh2 购自上海融禾公司; 人食管癌 Eca -109 细胞由河北省人民医院科研中心提供; RPMI1640 购于GIBCO 公司; Transwell 小室购于 Corning Costar 公司; Matrigel胶购于 BD 公司; 鼠抗人 TFPI -2 购于 R&D 公司; 鼠抗人 β -actin 抗体购于 Sigma 公司。

1. 2 实验分组 按人参皂苷 Rh2 不同浓度设置 3 个实验组( 10,40,80 mg/L) 和 1 个对照组。1. 3 人食管癌细胞 Eca -109 的培养 用含 10% 胎牛血清、100 IU/mL 青霉素和 100 IU/mL 链霉素的 RPMI1640 完全培养基,置于 37 ℃,5%CO 2 和饱和湿度条件下培养。

1. 4 TFPI -2 基因 mRNA 表达的检测 收集培养 48 h 后的1 为对照组,2 ~4 依次为 10,40,80 mg/L 人参皂苷 Ph2 组图 1 各组 Eca -109 细胞 TFPI -2mRNA 表达情况0. 595 ±0. 109,10,40,80 mg/L 人参皂苷 Rh2 依次为 0. 672 ±0. 104,0. 987 ±0. 095 和 1. 337 ±0. 550,40,80 mg/L 组与对照组比较均有显著性差异( P 均 <0. 05) 。见图 2。

A 为对照组; B ~ D 依次为 10,40,80 mg/L 人参皂苷 Rh2 组图 2 各组 Eca -109 细胞 TFPI -2 蛋白表达

2. 3 人参皂苷 Rh2 对 Eca -109 细胞侵袭力的影响 各组细胞均能侵袭到滤膜上,10,40,80 mg/L 组的穿膜细胞数分别为( 73 ±0. 058) 个,( 35 ±0. 094) 个和( 11 ±0. 120) 个,对照组为( 80 ±0. 087) 个。与对照组比较,40,80 mg/L 人参皂苷 Rh2组穿膜细胞数显著降低( P 均 < 0. 01) ,而 10 mg/L 组无显著性差异( P >0. 05) 。见图 3。A 为对照组; B ~ D 依次为 10,40,80 mg/L 人参皂苷 Rh2 组图 3 各组 Eca -109 细胞侵袭力比较

3 讨 论

TFPI -2 是近年来受到国内外高度重视的一种新的生理性调节因子,曾称为抗Ⅷ 因子( Ac) 、外源性通路抑制剂( EPI) 、凝血抑制因子( LACI) 等[5] 。深入研究发现,TFPI - 2是属于 Kunitz 型丝氨酸蛋白酶抑制物家族成员,TFPI - 2 基因位于人类 7 号染色体( 7q22) ,编码产物依糖基化程度不同分为27、31 和32 kD 3 种分子类型,体内主要以32 kD 的形式广泛存在于各种正常组织的 ECM 和 BM 中[2 -7] 。其在人类肝脏、肾脏、心脏、骨骼肌等正常组织中有着高度表达,而在肿瘤组织中却出现表达严重降低现象,甚至某些肿瘤细胞出现了 7 号染色体的等位缺失现象[6 -9] 。Rao 等 [10] 发现重组的TFPI -2 在体外能够抑制纤溶酶、胰蛋白酶、基质金属蛋白酶等的激活过程。Konduri 等[11] 报道了 TFPI -2 具有抑制黑色素瘤细胞、肺癌细胞以及神经胶质瘤细胞等肿瘤细胞侵袭力的作用。仲任等[12] 通过转染 TFPI -2 基因进入卵巢癌细胞,证实了 TFPI -2 基因表达的确可以抑制卵巢癌细胞的侵袭力。关于 TFPI -2 的作用机制,目前有 2 种说法: 一是认为TFPI -2 直接与肿瘤细胞分泌出的以及停留在肿瘤细胞表面的各种蛋白酶相互作用从而抑制了其生物学活性的发挥; 另一种是认为 TFPI -2 富含精氨酸的区域能与 ECM 大分子的结合,从而使 ECM 能增强抵御蛋白酶的降解能力

[4,11 -12] 。中医中药是我国的优势医疗资源,特别是从传统中草药提取的单体或有效成分,既保持有其天然温和的特性,又毒副作用轻微,具有很大的优势[13 -14] 。本文选择的经典中药提取物人参皂苷 Rh2,是从五加科多年生草本植物人参中提取的天然活性成分,分子式为 C 36 H 62 O 8 H 2 O,相对分子质量 622,化学名为 20( S) - 人参二醇 - 3 - 氧 - B - D - 吡喃葡萄糖苷,简称 Rh,属于小分子物质且为脂溶性。以往研究已经证实了它能在多个环节上抑制多种肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞凋亡等[14 -15] 。本实验结果提示,适宜浓度的人参皂苷 Rh2还具有上调人食管癌 Eca - 109 细胞的 TFPI - 2 基因表达和抑制肿瘤细胞侵袭力的功能。


 

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