人参皂苷 Rh2 对肺癌 A549 细胞 miR-16 和 Bcl-2 表达与生长的影响研究

发布日期:2020-12-29 13:22:49     浏览次数:10

摘要: 目的 探讨人参皂苷 Rh2(G-Rh2)诱导人肺癌细胞 A549 凋亡作用及机制研究。方法 采用 2. 5、5. 0、10. 0、20. 0、40. 0 μmol/L 的 G-Rh2 处理 A549 细胞,MTT 法于不同时间点测定 G-Rh2 对 A549 的生长抑制作用; 倒置显微镜观察 G-Rh2 对 A549 细胞作用后的形态改变; Annexin-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡情况; Real-time PCR 和 Western-blot 法分别检测 G-Rh2 对 A549 细胞中 miR-16 和 Bcl-2 蛋白表达的影响。结果 与阴性对照组相比,不同浓度 G-Rh2 能够抑制 A549 肺癌细胞增殖并呈时间 - 浓度依赖性; G-Rh2 作用后,A549 细胞凋亡率明显增加,miR-16 的表达显著增加,而 Bcl-2 蛋白表达显著降低。结论G-Rh2 能够显著抑制 A549 肺癌细增殖并通过上调 miRNA-16,下调 Bcl-2 的表达发挥治疗肺癌的作用。

关键词: 人参皂苷; 肺癌; miRNA-16; Bcl-2中图分类号: R734. 2 文献标志码: A文章编号: 1005-376X(2015)09-1027-04人参(Panax ginseng C. A. Mey是五加科植物人 参的根,历来被视为百草之王,是闻名遐迩的名贵药材,具有补气固脱,健脾益肺,宁心益智,养血生津的功效[1] 。近年来研究表明,人参提取物及衍生物在预防和治疗肿瘤方面具高效低毒的特点,受到人们的广泛关注。人参皂苷 Rh2(ginenoside-Rh2,G-Rh2)是在红参加工过程中生成的一种二醇组皂苷7 2 0 1 中国微生态学杂志 2015 年 9 月第 27 卷第 9 期 Chinese Journal of Microecology,Sep. 2015,Vol. 27 No. 9单体被认为是各种人参皂苷中抗肿瘤细胞增殖作用最强的一种[2-3] 。尽管大量研究表明 G-Rh2 能够通过诱导多种肿瘤细胞凋亡发挥其体内外广谱抗肿瘤活性,但其诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制及其完整的抗肿瘤作用仍不是很清楚肺癌在恶性肿瘤中的发病率和死亡率居世界第一位,且依然仍呈上升趋势。探讨肺癌的发病机制,找到药物的治疗靶点是目前医疗界亟待解决的重大课题miRNA 作为一种重要的基因表达调控因子,参与细胞增殖分化及多种肿瘤细胞的发生、发展、迁移、侵袭及耐药过程[4] 。本实验研究了 miR-16 和 Bcl-2 在肺癌细胞株A549 中表达的变化及 G-Rh2 的干预作用,旨在探讨肺癌发病的分子机制,为肺癌的早期诊断和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 主要药品与试剂 G-Rh2(批号: 20120115,原料药粉末,纯度≥98%,购自上海源叶生物科技有限公司); 胎牛血清,RPMI 1640 培养基,F12 培养液(美国 Gibcol 公司); DMSO,四甲基偶氮唑蓝(MTT),胰蛋白酶(上海生工程有限公司); Trizol试剂,RT-PCR 试剂盒,引物合成(大连 TaKaRa 公司); SYBR green PCR master Mix 试剂盒(英国 ABapplied biosystems); 兔抗人单克隆抗体(武汉博士德生物公司); 羊抗兔 IgG(北京中杉公司),AnnexinV-FITC/PI 凋亡检测试剂盒(美国 BD 公司)。

1. 2 方法

1. 2. 1 细胞株及其培养 人肺癌细胞 A549 购自中科院上海细胞生物学研究所,接种于含有 10% 胎牛血清的 F12 培养液中,置 37 ℃、5% CO 2 饱和湿度环境下培养,贴壁生长,每 2 d 传代 1 次。1. 2. 2 MTT 法检测 G-Rh2 对 A549 细胞的细胞毒作用 取对数生长期的 A549 细胞制成单细胞悬液,调整细胞浓度,以 2 × 10 4 个/孔接种到 96 孔板中,培养过夜使细胞贴壁。阴性对照组加入含 1% DM-SO 的1640 培养液100 μL/孔,给药组分别加入终浓度为 2. 5、5. 0、10. 0、20. 0、40. 0 μmol/L 的 G-Rh2,100 μL/孔,于培养箱中分别培养 12、24 和 48 h 后,每孔加入浓度为 5. 0 mg/mL 的 MTT 10 μL,继续培养 4 h,吸净培养液后每孔加入 100 μL 二甲基亚砜(DMSO)震荡 10 min,使结晶物充分溶解。置酶标分析仪于 490 nm 处测量各孔吸光度(A)值,计算每个加药组细胞的存活率,实验重复 3 次。1. 2. 3 倒 置 显 微 镜 下 观 察 细 胞 的 形 态40. 0 μmol/L的 G-Rh2 作用 24 h 后,倒置显微镜下观察 G-Rh2 处理前后 A549 细胞形态的变化。1. 2. 4 流式细胞仪分析细胞凋亡率 取对数生长期的 A549 细胞,以 1 ×10 6 个/mL 的浓度接种于 6 孔板中,贴壁 24 h 后分别加入终浓度为 10. 0、20. 0 和40. 0 μmol/L 的 G-Rh2。药 物 作 用 24 h 后, 用0. 25%的胰蛋白酶消化,收集 1 ×10 5 个细胞,加入500 μL 的 1 × Binding Buffer,加入 5 μL AnnexinV-FITC,10 μL PI,混匀,室温下反应 15 min,1 h 内进行流式细胞仪检测。1. 2. 5 Real-time PCR 检测 A549 细胞内 miR-16 的表达 采用 Trizol 法提取细胞 RNA,通过 A 260 /A 280 及A 260 /A 230 的吸收比值判断 RNA 的纯度。将 RNA 逆转录合成 cDNA,然后以 cDNA 作为模板进行实时定量PCR 扩增(U6snRNA 为内参)。采用 SYBR Green I进行相对定量分析,按照 ΔΔCt 解析法来进行设计,实验重复 3 次。miR-16 上游引物序列为: 5'-UAG-CAGCACGUAAAUAUUGGCG-3'; 下游引物序列为:5'-CCAAUAUUUACGUGCUGCUAUU-3'。反 应 条 件为: 95 ℃ 预变性 20 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,70 ℃延伸 10 s,40 个循环,每个循环 72 ℃时测定各管的荧光值。1. 2. 6 Western-blot 法检测 A549 细胞中 Bcl-2 蛋白

的表达 对数生长期的 A549 细胞经药物(40. 0μmol/L)处理 24 h 后,加入细胞裂解液 RIPA,使用前加入1 mmol/L 蛋白酶抑制剂 PMSF 在冰上裂解30min,于4 ℃ 12 000 g 离心15 min,取上清液。蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝法。SDS 聚丙稀酷胺凝胶电泳分离蛋白质,将蛋白转移到 PVDF 膜上常规一抗和二抗孵育后,ECL plus 超敏免疫印迹检测试剂检测蛋白表达,暗室曝光获取图像。1. 2. 7 统计学处理 采用统计学软件 SPSS 13. 0 进行方差分及 T 检验,结果以(x ± s)表示,P <0. 05为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 G-Rh2 对 A549 细胞增殖的抑制作用 由图 1 可见,以未处理细胞存活率为 100% 作参照,不同浓度 G-Rh2 处理的 A546 细胞的增殖均受到不同程度的抑制,且呈浓度和时间的依赖性。2. 2 G-Rh2 处理后细胞形态的变化 40. 0 μmol/LG-Rh2 处理 24 h 后,光学显微镜下可见 A549 细胞形态发生明显变化,凋亡细胞数显著增多,细胞大小不一,出现皱缩、变圆和脱落,见图 2。2. 3 G-Rh2 对 A549 细胞凋亡的影响 采用 10. 0、20. 0 和 40. 0 μmol/L 的 G-Rh2 处理 A549 细胞 24 h,8 2 0 1 中国微生态学杂志 2015 年 9 月第 27 卷第 9 期 Chinese Journal of Microecology,Sep. 2015,Vol. 27 No. 9经 Annexin-FITC/PI 双染法检测发现,G-Rh2 能够诱导 A549 细胞凋亡,3 种浓度的 G-Rh2 引起的 A549细胞早期凋亡率为 12. 74% ~ 25. 02% (12. 74% ±2. 63%,19. 68% ±4. 44%,25. 02% ±3. 37%)。并

随 着 给 药 浓 度 的 增 加 而 增 加, 与 阴 性 对 照(0 μmol/L,3. 80% ±0. 89%)相比差异有统计学意义(P <0. 01)。2. 4 G-Rh2 对 A549 细胞内 miR-16 的表达的影响采用 Real-time PCR 方法对 A549 细胞内 miR-16 的含量进行准确检测,以 U6snRNA 为内参照获得 miR-16 在样本中的拷贝数。与阴性对照组相比,miR-16在给药组(40. 0 μmol/L) 细胞中的表达显著增高(P <0. 01),见图 3。120100605030200 02.4 4 10 20 307=@@ C?;<?@?D,+-8G:>2,FAB@/9-12 >23 >36 >注: 0 μmol/L 为阴性对照组; 与阴性对照组相比, a P <0. 05。图 1 G-Rh2 对 A549 细胞增殖的影响(n =5)

注: a 为阴性对照组; b 为 40. 0 μmol/L G-Rh2 给药组。图 2 光学显微镜下 A549 细胞的形态( ×400)0-20-10/-4/-3/-2/-1/@>9E03.;3:CA856E9=1+/ D@B?.7, 6E9=1+2/ D@B?.7,<注: 0 μmol/L 为阴性对照组; 与阴性对照组相比, a P <0. 01。图 3G-Rh2 对 A549 细胞中 miR-16 表达的影响2. 5 G-Rh2 对 A549 细胞中 Bcl-2 蛋白的表达的影响 有研究表明,Bcl-2 的 3'-UR 区存在 miR-16 的调节位点,说明 miR-16 可能调控癌基因 Bcl-2 的表达5] 。因此我们采用 Western-blot 方法进一步分析A549 细胞中 Bcl-2 蛋白的表达情况,结果表明给药组(40. 0 μmol/L)细胞 Bcl-2 蛋白的表达较阴性对照组明显减少(P <0. 01),见图 4。058?.=?45<7:1?36. - >9;8,2 /-+->9;8,2图 4G-Rh2 对 A549 内 Bcl-2 蛋白表达的影响3 讨 论人参是古今著名的珍贵药材,近年来,药效学、临床观察及流行病学研究均证实它具有广泛作用和

多种生物学活性。人参皂苷 Rh2 是人参最主要的活性成分之一,国内外大量研究证实 G-Rh2 在能够抑制肝癌、宫颈癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生、发展

[6-8] ,但其具体的作用机制还不清楚。已有文献报道 G-Rh2 可以抑制肺癌细胞的生长 [9] 。miRNA 是一类高度保守的小片段内源性非编码RNA,广泛存在于动植物中。成熟的 miRNA 能够与靶基因 mRNA 碱基配对,从而与沉默复合体(RISC)结合形成复合物,进一步通过降解 RNA 或抑制 mR-NA 的翻译调控目的基因的表达。miRNA 参与了一系列细胞生长和发育过程,包括调控增殖、分化、凋亡和新陈代谢等[10-11] 。除此之外,大量证据表明miRNA 与人 类 癌 症 的 发 生、发 展 和 预 后 密 切 相关

[12] 。miR-16 是 miRNA 大家族中的成员之一,定位于人类基因组脆性位点: 染色体 13ql4. 3。己有研究表明,miR-16 在许多肿瘤疾病中表达下调或不表达[13] ,说明它可能是一种抑癌基因。Bcl-2 是公认的哺乳动物细胞凋亡的调节基因,参与维持细胞分化与数量的动态平衡。在肿瘤中的作用是稳定细胞内质膜系统,抑制细胞色素 C 的释放从而诱导肿瘤细胞增殖,增加其侵袭能力及对抗肿瘤药物的耐药性。有文献报道[14] ,miR-16 可以通过转录后水平靶向作用于 Bcl-2 蛋白而诱导细胞凋亡,因此,miR-16

已成为 Bcl-2 蛋白高表达的恶性肿瘤的药物作用靶点。近几年,有关 G-Rh2 广谱抗肿瘤作用的报道越来越多,但其通过调控 miRNA-16 的表达而诱导A549 细胞凋亡的研究尚未见报道。本研究结果表明,人参的主要活性成分 G-Rh2能够显著抑制肺癌 A549 细胞的增殖并呈时间 - 浓度依赖性。与阴性对照组相比差异具有统计学意义(P <0. 05)。形态学观察和细胞凋亡检测结果显示G-Rh2 能诱导 A549 凋亡,抑制其生长。进一步的分析发现,miRNA-16 在用药组的表达明显增加,提示其在抑制肿瘤生长方面可能具有重要作用,是一种潜在的抑癌基因。为了探讨 miRNA-16 诱导凋亡的可能机制,本研究检测了 Bcl-2 蛋白的表达水平,结果显示 Bcl-2 蛋白在药物处理后表达下调,这提示miRNA-16 通过负调节 Bcl-2 的表达参与了 G-Rh2 对肺癌 A549 细胞的抑制作用,可能是 G-Rh2 治疗肺癌的机制之一。

综上所述,G-Rh2 抑制 A549 细胞的增殖和诱导细胞的凋亡可能是通过上调 miRNA-16,下调 Bcl-2的表达来实现的,然而其具体参与的信号转导通路还需进一步深入研究。

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