人参皂苷 Rh 2 通过自噬途径对 KG1α 细胞增殖和凋亡的影响

发布日期:2021-01-04 14:01:09     浏览次数:12

摘 要:目的 研究人参皂苷 Rh 2 (Rh 2 )对人白血病细胞 KG1α 增殖的抑制作用,并从自噬凋亡角度来探讨其机制。方法 采用 CCK-8 法检测 Rh 2 对 KG1α 细胞增殖的抑制作用;流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡;Hoechest 染色观察细胞核染色质的形态;吖啶橙染色观察 Rh 2 对细胞自噬的影响;Western blotting 和 RT-PCR 检测 Rh 2 对白血病细胞自噬重要蛋白和基因表达的影响;运用自噬抑制剂(3-MA)研究自噬对细胞增殖和凋亡的影响。结果 CCK-8 显示 Rh 2 在低浓度时能有效抑制 KG1α细胞增殖,且其抑制作用具有浓度和时间依赖性;FCM 检测和 Hoechest 染色结果显示 Rh 2 能增加细胞的凋亡,使染色质呈凋亡形态改变;吖啶橙染色发现 Rh 2 组细胞绿色荧光增强,细胞出现大量的酸性自噬小泡;Western blotting 和 RT-PCR 结果发现 Rh 2 上调 Beclin-1、LC3A、LC3B、激活型 Caspase-3 表达和增加 Bax/Bcl-2 值,并激活 MAPK、ATK、ERK 信号通路;细胞自噬剂(3-MA)会削弱 Rh 2 对 KG1α 细胞的增殖抑制和促凋亡作用。结论 Rh 2 可能通过激活 MAPK、ATK、ERK 信号通路,诱导细胞自噬途径,从而抑制 KG1α 细胞增殖和促进其凋亡。人参 Panax ginseng C. A. Mey. 作为中国传统医学中的“补气”良药已运用千年之久 [1] 。人参皂苷 Rh 2(Rh 2 )是人参天然活性成分之一,是1 种从红参中分离得到的原人参二醇型单糖链皂苷单体化合物,其毒性低、相对分子质量小、脂溶性好,具有很强的抗肿瘤活性 [2] 。近年来对其在抗肿瘤作用方面的研究表明,Rh 2 的抗肿瘤作用较为广泛,既可阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤的生长、诱导肿瘤细胞分化使其逆转、抑制肿瘤的转移,又可通过影响和调节机体免疫功能,增强机体对疾病的抵抗能力,从而抑制肿瘤生长,还可增强抗癌药的药效 [3] 。在真核生物中,自噬是一种高度保守的生物学过程,能维持细胞的代谢平衡 [4-5] 。目前认为,细胞死亡包括 3 种类型,即坏死、凋亡和自噬性细胞死亡。细胞程序性死亡中,自噬可能比凋亡扮演更为主动和重要的角色 [6] 。自噬对肿瘤细胞起到双刃剑作用,可以保护肿瘤细胞,也可以杀伤肿瘤细胞 [7] 。因此,本实验研究 Rh 2 对人白血病细胞 KG1α 增殖的影响,并从自噬凋亡角度来探讨其作用机制,为 Rh 2应用于临床治疗白血病奠定实验和理论基础。

1 材料

1.1 细胞株

人白血病KG1α 细胞株购自上海ATCC 细胞库。每次取对数生长期的 KG1α 细胞以 5×10 8 /L 接种于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中,在 37 ℃、5% CO 2 饱和湿度下培养,每 2~3 d 传代或换液。

1.2 药品Rh 2 购自成都曼斯特科技有限公司(批号78214-33-2,质量分数 98%),取 200 μL DMSO 加入 20 mg Rh 2 使之充分溶解,配制成 100 mg/L 原液,−20 ℃冷冻保存。实验前用含 10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培养液稀释成所需浓度。

1.3 试剂胎牛血清、RPMI 1640 培养基(美国 Hyclone公司);CCK-8 试剂盒(日本同仁化学研究所);Annexin V-PI 双标凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司);TAKARA 反转录酶试剂盒、SYBR II 试剂(Takara 公司);吖啶橙、MDC 染液、3-甲基腺嘌呤(3-MA)自噬抑制剂(美国 Sigma 公司);MAPK通路抗体试剂盒、Beclin-1、LC3A/B 多克隆抗体、Bcl-2、Bax 多克隆抗体(美国 Epitomics 公司)。Caspase-3、Atg3、Atg5、Atg7Atg12 抗体(美国Cell Signaling Technology 公司)。

1.4 仪器超净工作台(Sanyo 公司);倒置显微镜、倒置荧光显微镜(Olympus 公司);低温离心机(Sigma公司);酶标仪、垂直电泳仪、电转仪、ChemiDocXRS化学发光成像系统、PCR 仪(Bio-Rad 公司);二氧

化碳培养箱(Thermo 公司)。2 方法2.1 CCK-8 法测定细胞增殖培养对数生长期的 KG1α 细胞,以 1×10 4 /孔接种于 96 孔板中,每孔加入的细胞液体积 10 μL。分为空白对照组、Rh 2 药物组和本底对照组,每组设 6个复孔,每孔加入 200 μL 药物,空白对照组加入细胞及等量培养液,Rh 2 药物组入相应浓度(20、40、60、80、100 μmol/L)的 Rh 2 ;本底对照组只加 RPMI1640 培养液。各组培养 24、48、72 h 后,每孔加入10 μL CCK-8 检测液,轻轻摇匀,孵育 2.5 h 后,用酶标仪(波长 450 nm)检测每孔吸光度(A)值,并计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度(IC 50 )。增殖抑制率=1-(A 空白对照 -A 本底对照 )/(A 药物组 -A 本底对照 )2.2 流式细胞仪检测细胞早期凋亡培养对数生长期的 KG1α 细胞,调整细胞浓度为 5×10 8 /L,接种于 6 孔细胞培养板中,每孔加入200 μL。实验分为空白对照组、Rh 2 (60 μmol/L)组。每孔 3 mL 培养液,在 37 ℃,5% CO 2 饱和湿度下培养 24 h 后,分别收集各组细胞,用预冷 0.01 mol/LPBS(pH 7.2)洗涤 2 次,4 ℃、1 200×g,离心 5 min。加入 RNA 酶、碘化丙啶(PI)和膜联蛋白 V(AnnexinV),置于冰上染色处理 30 min,每组细胞 2×10 4 个,

上流式细胞仪检测,重复实验 3 次。2.3 Hoechst 染色取对数生长期的 KG1α 细胞,调整细胞密度为5×10 8 /L,接种于 6 孔培养板,每孔加入 200 μL。实验分为空白对照组(含0.1% DMSO的RPMI 1640完全培养液)、药物组(加入60 μmol/L的Rh 2  6 mL),培养 48 h 后,收集空白对照组和物组细胞,用预冷 PBS 洗涤 2 次,加甲醇-乙醇(3∶1)固定液室温固定 15 min;离心去除固定液加 Hoechst 染色液避光、室温染色 30 min,PBS 洗涤 1 次,调整细胞浓度,滴片,荧光显微镜下观察。2.4 吖啶橙染色KG1α 细胞用 Rh 2 (60 μmol/L,3 mL)处理 24h 后,收集细胞,选新配制的吖啶橙(2 μmol/mL),37 ℃避光孵育 15 min,在 EP 管中,用 PBS 漂洗 3次后,调整细胞浓度,取 1 滴细胞悬液滴到玻片上,待细胞沉积到玻片上时,吸去上层液体,封片置于荧光显微镜下观察酸性的自噬小泡。50%甘油封片,置于倒置荧光显微镜下观察、采图,实验重复 3 次。2.5 Western blotting 法检测凋亡及自噬相关蛋白表达取对数生长期的 KG1α 细胞,调整细胞浓度到5×10 8 /L,接种到细胞培养瓶中。实验分组为对照组和药物组(分别加入 Rh 2 10、20、40、60 μmol/L),置培养箱中常规培养。提取蛋白并将各组蛋白质量浓度调成 4 μg/μL,使蛋白完全变性后,冷却,每个样品取 10 μL 加入泳道中,保证每孔中有 40 μg待测蛋白样品,SDS-PAGE 电泳后电转移至 PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭 2 h 后,分别加入 MAPK信号通路抗体(1∶500)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Caspase-3(激活型,1∶1 000)、LC3A(1∶1 000)和 LC3B(1∶1 000)、Beclin-1 (1∶2 000)、β-actin(1∶2 000),4 ℃孵育过夜;置于脱色摇床上,用TBST漂洗3 次,每次10 min。分别加入以1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记二抗,再用 TBST 漂洗 3次,每次 10 min;最后在保鲜膜上滴入 ECL 化学发光液,在暗室进行 X 胶片曝光,洗片。胶片晾干后扫描胶片,用 Quantity One 软件定量分析。重复3 次。2.6 RT-PCR 法检测自噬重要基因表达参照试剂盒说明书进行,Trizol提取细胞总RNA。采用 TAKARA 反转录酶试剂盒逆转录 cDNA。应用TAKARA 的 SYBR II 试剂检测自噬重要基因的

mRNA 水平,PCR 反应体系为 10 μL。引物由上海生工生物公司提供,引物序列见表 1。以 GAPDH 为内参基因,用目的基因与 GAPDH 的起始拷贝数比值表示目的基因的相对表达量,实验重复 3 次。2.7 3-MA 和 Rh 2 联用对细胞增殖和凋亡的影响实验分为 4 组,空白对照组、Rh 2 (60 μmol/L)组、3-MA(5 mmol/L)组及 Rh 2 (60 μmol/L)+3-MA(5 mmol/L)组,分别以 CCK-8 法、流式细胞仪、Western blotting 法检测细胞增殖、凋亡及蛋白表达。

2.8 统计学方法

所有数据用 SPSS 22.0 软件进行统计分析,数

据均用 s x 表示,多组均数间比较用双因素和单

因素方差分析,组间两两比较用 LSD 法。

3 结果

3.1 Rh 2 对 KG1α 细胞增殖的抑制作用CCK-8 检测结果(图 1)显示,药物组与空白对照组比较,Rh 2 能有效抑制白血病 KG1α 细胞增殖,并呈浓度和时间依赖性。且 Rh 2 作用 KG1α 细胞 48 h 的 IC 50 为 60 μmol/L。因此,选择 Rh 2 60μmol/L 作为后续实验最高浓度。

3.2 Rh 2 对 KG1α 细胞凋亡的影响Rh 2 (60 μmol/L)处理 KG1α 细胞 24 h 后,流式细胞仪检测结果显示加药组早期和晚期凋亡细胞数量明显增多,其早期凋亡率为(12.00±2.60)%,与空白对照组[(3.18±0.52)%]相比,差异有统计学意义(P<0.05);晚期凋亡率为(16.32±3.45)%,与空白对照组[(3.19±0.73)%]相比,差异均有统计学意义(P<0.05),见图 2。3.3 Rh 2 对 KG1α 细胞核形态的影响Rh 2 (60 μmol/L)诱导 KG1α 细胞 48 h 后,用Hoechst 染色显示,细胞核出现染色质浓缩、核碎裂、核边集的细胞凋亡现象,并且细胞发出的蓝色荧光较空白对照组细胞强,说明 Rh 2 能诱导 KG1α细胞凋亡(图 3)。3.4 吖啶橙染色观察细胞自噬Rh 2 (60 μmol/L)处理 KG1α 细胞 24 h 后,用吖啶橙染色,观察细胞内的自噬体(图 4),细胞内绿色代表酸性自噬小泡,红色代表核仁,经 Rh 2 诱导后 KG1α 细胞中的酸性自噬小泡均明显增加,对照组绿色的自噬小泡基本看不见。图 3 Hoechst 染色检测细胞凋亡Fig. 3 Apoptosis of KG1α cells detected by Hoechst staining图 4 吖啶橙染色检测细胞自噬Fig. 4 Cell autophagy detected by acridine orange staining3.5 Rh 2 对 KG1α 细胞凋亡相关蛋白表达的影响Western blotting 检测结果显示,KG1α 细胞经不同浓度的 Rh 2 (20、40、60 μmol/L)作用 48 h 后,与对照组比较,药物组中 Bcl-2 蛋白随 Rh 2 浓度升高表达水平反而降低;Bax、Caspase-3(激活型)蛋白随Rh 2 浓度升高表达水平明显升高(图 5)。图 5 Rh 2 对KG1α 细胞Bcl-2 、 Bax 、Caspase-3 蛋白表达的影响Fig. 5 Effect of Rh 2 on expression of Bcl-2, Bax, Caspase-3in KG1α cells3.6 Rh 2 调控 MAPK 、AKT 、ERK 信号通路10、20、40、60 μmol/L Rh 2 作用于 KG1α 细胞24 h 后,Western blotting 结果显示,p38、JNK 和ERK 蛋白的表达几乎没变化,p-p38 和 p-JNK 的表达增加,p-ERK 的表达下降,提示 Rh 2 能影响MAPK、AKT、ERK 信号通路,见图 6。3.7 Rh 2 对 KG1α 细胞自噬重要基因表达的影响RT-PCR 检测结果如图 7 所示,与对照组比较,KG1α 细胞经60 μmol/L 的Rh 2 作用24 h 后,自噬相关基因(Atg3、Atg5、Atg7、Atg12)在2 组细胞中变化不明显,而自噬重要调控基因Beclin-1、LC3A、LC3B的表达却明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。对照Rh 2(60 μmol·L −1 )Bcl-2Bax自噬抑制剂 3-MA 后,细胞自噬关键蛋白 LC3A/B表达有下降的趋势,单独运用 Rh 2 后,细胞自噬关键蛋白 LC3A/B 和激活型的 Caspase-3 表达明显上升,当同时加入自噬抑制剂 3-MA 和 Rh 2 后,细胞的自噬关键蛋白 LC3A/B 和激活型 Caspase-3 的表达比单独运用 Rh 2 时明显下降,说明抑制自噬后细胞凋亡现象减少,自噬可促进人参皂苷 Rh 2 诱导KG1α 的凋亡作用。

4 讨论

自然界中有丰富的抗肿瘤天然药物,本课题组前期实验表明人参提取物中人参总皂苷和单体能在体外抑制白血病和肝癌细胞增殖、阻滞周期、促进凋亡。国内外研究证实,人参皂苷单体能抑制各种肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞发生凋亡 [8-9] 。Rh 2含有单糖,研究发现,化学结构中含有的糖结构越少时,抗肿瘤的活性越强 [10] 。因此本实验采用CCK-8 法研究 Rh 2 对白血病细胞 KG1α 增殖抑制作用,发现 Rh 2 能有效抑制白血病细胞的增长。通过FCM 检测和 Hoechst 染色发现 Rh 2 能促进细胞发生凋亡。Western blotting 检测发现 Rh 2 能够增加Bax/Bcl-2 的比例,同时激活 Caspase-3,说明了 Rh 2能通过线粒体途径诱导细胞发生凋亡。细胞自噬和凋亡密切相关,凋亡的早期,细胞出现应激反应,会出现自噬。为了探讨 Rh 2 对白血病细胞自噬的影响,运用吖啶橙和 Hoechst 染色,发现加药组早期细胞出现酸性的自噬小泡。PCR 和Western blotting 结果显示自噬相关基因和蛋白分子(Beclin-1、LC3A 和 LC3B)的表达均升高,证明了Rh 2 能诱导白血病细胞发生自噬。自噬异常与肿瘤的发生发展关系密切,可以从不同生物学行为影响肿瘤的进程,其中有细胞周期、增殖、凋亡、耐药、血管生成及肿瘤的治疗等方面

的调控 [11] 。自噬和细胞凋亡的关系存在两面性,维持细胞生存和促进细胞死亡 [12] 。本课题组前期实验证明了 Rh 2 既能诱导白血病 KG1α 细胞凋亡又能诱导其发生自噬,那么细胞自噬和凋亡关系是怎样的呢?实验表明,当同时加入自噬抑制剂3-MA和Rh 2时,与单独加入 Rh 2 相比,KG1α 的细胞凋亡减少和细胞活力增强。说明抑制细胞自噬,可削弱 Rh 2对白血病细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用,提示Rh 2 可以通过诱导白血病细胞发生自噬而促进细胞凋亡。目前,MAPK、AKT 和 ERK 信号通路能调控自噬和细胞凋亡 [13-14] 。前期研究证实 Rh 2 诱导细胞自噬,3-MA 通过抑制 Class III PI3K 的活性抑制自噬,抑制细胞自噬可以削弱 Rh 2 对 KG1α 的抑制增殖和促凋亡作用。为了研究 Rh 2 诱导细胞自噬凋亡的可能机制,本实验运用 Western blotting 检测MAPK、AKT 和 ERK 信号通路的关键蛋白,发现Rh 2 能够激活 p38、JNK、ERK,使其磷酸化,证明了 Rh 2 诱导细胞自噬凋亡可能是通过激活 MAPK、AKT 和 ERK 信号通路实现。

 

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