人参皂甙 Rg3 对前列腺癌细胞的作用研究

发布日期:2020-09-14 10:19:12     浏览次数:3

人参皂甙 Rg3 对前列腺癌细胞的作用研究

尹怀福,修有成,赵维明,金承俊,张子健

(哈尔滨医科大学 附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150001)

[摘要]目的:通过研究人参皂甙 Rg3(GS - Rg3)对前列腺癌 LNCaP 细胞增殖和凋亡的作用及其相关分子生物学机制,为前列腺癌的药物治疗提供新的方向。方法:分别用不同浓度的 GS - Rg3 作用于 LNCaP 细胞48 h,通过 MTT 法及流式细胞仪检测 LNCaP 细胞增殖及凋亡的情况;利用 RT - PCR 技术测 LNCaP 细胞凋亡相关基因 caspase - 3、Bcl - 2 及前列腺标志基因雄激素受体(AR)、5α 还原酶(5α - R)及前列腺特异性抗原(PSA)的表达。

结果:(1) GS - Rg3 对前列腺癌细胞系 LNCaP 的增殖有明显的抑制作用,而且呈剂量依赖性;

(2) GS - Rg3 可以诱导 LNCaP 细胞剂量依赖性的凋亡,该凋亡与增强 caspase - 3 及抑制 Bcl - 2 基因表达相关;

(3) GS - Rg3 可以抑制 LNCaP 细胞前列腺标志基因 AR、5α - R 及 PSA 的表达。结论:GS - Rg3 可以抑制LNCaP 细胞增殖,诱导细胞凋亡,对雄激素依赖性 LNCaP 细胞具有多重抗癌作用。

[关键词]人参皂甙 Rg3; 前列腺癌 LNCaP 细胞; 凋亡; 基因表达

[中图分类号]R966 [文献标识码]A [文章编号]1671 - 7562(2016)01- 0001 - 06前列腺癌(prostate cancer,PCa)是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤,是前列腺腺泡细胞异常无序生长的结果。在美国,PCa 发病率居所有男性恶性肿瘤第一位,死亡原因的第二位 [1-2] 。因为种族、遗传、环境等因素的影响,在中国及一些其他的亚洲国家PCa 的发病率远远低于欧美国家,但是近年来的发病率也呈明显上升趋势。局限性 PCa 通过根治术或放疗是可以治愈的。因为前列腺是雄激素依赖性器官,转移性 PCa 只能通过激素治疗联合化疗及生物治疗来有效控制,其主要的负面影响是药物的抗药性和毒副作用。因此,寻找更新的有效而安全的 PCa 治疗药物是目前需要解决的课题。

1 材料与方法

1. 1 材料

人 PCa 雄激素依赖性细胞系 LNCaP 购自中国科学院上海细胞库,RPMI 1640 培养液购自美国 Gibco公司,胎牛血清购自美国 Hyclone 公司,RNA PCR 逆转录试剂盒(AMV) Ver. 3. 0 购自日本 TaKaRa 公司,Annexin Ⅴ/FITC - PI 凋亡试剂盒购自美国 BD 公司,Trizol 试剂、双抗(青霉素/链霉素)、四氮唑蓝(MTT)、

二甲基亚矾(DMSO)购自美国 Invitrogen 公司,逆转录扩增引物购自上海英俊生物有限公司,人参皂甙 Rg3(ginsenoside Rg3,GS - Rg3)(纯度 > 99%)购自天津马克生物有限公司,光学显微镜购自日本 OLYMPUS 公司,全自动酶标仪购自德国 BMG LABTECH 公司,流式 细 胞 仪 购 自 美 国 BD 公 司,PCR 仪 ( Rotor -Gene3000)购自澳大利亚 Corbett 公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 细胞培养 将雄激素依赖性细胞系 LNCaP 培养在含体积分数 10% 胎牛血清、100 U·ml

-1 青霉素和 100 μg·ml-1链霉素的 RPMI 1640 培养液中,于37 ℃、体积分数 5%CO 2 培养箱中常规培养,每隔72 h换液1 次,以1∶ 2 的比例7 d 传代1 次,取10 ~15 代细胞用于实验。

1. 2. 2 MTT 比色法检测细胞活性 MTT 法检测LNCaP 细胞增殖情况。取生长状态良好的对数生长期 LNCaP 细胞以 3 ×10 3 ml-1 的密度接种于 96 孔板,每孔 200 μl 培养液,贴壁培养 24 h,分别加入 200 μl浓度为 050、125、250、500、600、800 μmol·L-1的GS - Rg3溶液,每个浓度做 5 组重复试验,作用 48 h。每孔加入 5 mg·ml-1的 MTT 溶液 20 μl,37 ℃ 育

4 h,弃掉孔中液体加入 DMSO 150 μl,振荡使紫色结晶充分溶解后,用全自动酶标仪于波长为 570 nm 处测定各孔的 OD 值。增殖抑制率 = (阴性对照组 OD 值 -实验组 OD 值) /阴性对照组 OD 值 ×100%。

1. 2. 3 细胞凋亡测定 利用流式细胞仪检测 GS - Rg3

诱导 LNCaP 细胞的凋亡情况。取对数生长期细胞,接种在6 孔板上,分别用浓度为 0、125、250、500 μmol·L-1 的GS - Rg3 溶液处理细胞48 h 后用0. 25%胰蛋白酶消化收集细胞,用 PBS 洗涤细胞 2 次(2 000 r·min-1 ,4 ℃离心 5 min),弃去上清液,每样本细胞数为(1 ~ 5) ×10 5 。取 500 μl 胞悬液,加入 5 μl AnnexinⅤ - FITC及 5 μl PI,混匀后室温下避光反应 15 min。利用流式细胞仪检测:凋亡率为早期凋亡(AnnexinⅤ - FITC 阳性,PI 阴性)率与晚期凋亡(AnnexinⅤ - FITC 阳性,PI阳性)率之和。1. 2. 4 RT - PCR RT - PCR 技术检测 GS - Rg3 引起LNCaP 细胞凋亡相关基因及前列腺标志基因表达的改变。取对数生长期细胞,接种在 6 孔板上,分别用浓度为 0、125、250、500 μmol·L-1 的 GS - Rg3 溶液处理细胞 48 h 后,过 RT - PCR 法检测细胞中凋亡相关基因 caspase - 3、Bcl - 2 及前列腺标基因雄激素受体(androgen receptor,AR)、5α 还原酶(5α reductase,5α -R)及前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)的表达,用 0.25%胰蛋白酶消化收集细胞,Trizol试剂提取细胞总 RNA,利用 RNA PCR 逆转录试剂盒(AMV)Ver. 3. 0 逆转录为 cDNA,PCR 扩增所用引物序列详见表 1。扩增参数:94 ℃ 5 min 预变性;94 ℃30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,共 35 个循环;最后 72 ℃10 min 延伸。反应结束后,扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳,EB 染色后读取扩增条带的光密度值进行分析,以目标基因与内参基因 GAPDH 扩增产物的光密度值的比值计算表达水平。

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